Ферменты, катализирующие гидролиз полисахаридов, можно условно разделить на эндоферменты, действующие на связи в пределах молекулярной структуры макромолекулы, и экзоферменты, которые действуют на концах (или вблизи них) основных или боковых цепей. Примером эндоферментов могут служить эндо-бета-глюканаза, полигалактуроназа и альфа-амилаза; примером экзоферментов — 1,4-амилоглюкозидаза и бета-амилаза.
Ферменты, гидролизующие смешанные полисахариды (цитолитические ферменты, гумазы), были изучены на непроросшем и проросшем ячмене; при исследовании же ферментов пшеницы внимание было сосредоточено почти исключительно на альфа- и бета-амилазах, которые гидролизуют составные части крахмала, амилозу и амилопектин. Наши сведения о карбогидразах пшеницы с достаточной полнотой были изложены в 1946 г.
Настоящая глава в основном касается литературных данных, опубликованных позднее.
В кристаллическом виде альфа- и бета-амилазы были выделены после 1946 г. В 1949 г. Швиммер и Боллс описали метод выделения и кристаллизации альфа-амилазы из проросшего ячменя. Как установлено, альфа-амилаза из пшеницы или ячменя не действует на неповрежденные зерна крахмала. Поврежденные зерна крахмала она гидролизует с небольшой скоростью, а клейстеризованный крахмал — со значительной скоростью. По-видимому, альфа-амилаза гидролизует 1,4-альфа-глюкозидную связь в случайных точках молекулы крахмала. Уменьшение вязкости крахмального клейстера можно заметить даже раньше, чем удается с помощью химических методов установить присутствие восстанавливающих групп. Продолжительный гидролиз приводит к образованию глюкозы, мальтозы и низкомолекулярных полисахаридов как из амилазы, так и из амилопектина. Бета-амилаза была получена в кристаллическом виде из ячменного солода Фишером с сотр. в 1950 г., а из пшеницы — в 1953 г.
Подобно бета-амилазе из солода фермент из пшеницы не требует ионов кальция или хлора и необратимо инактивируется ионами меди и ртути. Бета-амилаза отщепляет бета-мальтозу от невосстанавливающего конца цепочки крахмала. Ее действие на амилозу приводит к полному гидролизу последней до мальтозы. При действии бета-амилазы на амилопектин образуется мальтоза и около 40% декстрина, который называют по-разному: бета-декстрином, предельным декстрином или эритродекстрином. Полагают, что действие бета-амилазы резко приостанавливается, когда у мест ветвления, молекулы амилопектина, содержащих 1,6-альфа-глюкозидные связи остается всего несколько молекул глюкозы. Присутствие альфа-амилазы усиливает действие бета-амилазы, поставляя субстрат для действия экзофермента.
По функциональному признаку методы анализа пшеничных амилаз можно разделить на методы определения ферментативной активности с использованием известных субстратов и автолитические методы анализа амилаз в присутствии углеводов пшеницы в условиях практического их использования. Такое разделение не является совершенно безусловным, но может иметь значение для наших представлений об аналитических методах.
Примером первого типа служит определение альфа-амилазы с помощью вискозиметрии с клейстеризованной амилозой или гидроксиэтилированным крахмалом при оптимальных значениях рН и температуры.
В этом случае единственным лимитирующим фактором является концентрация фермента и зависимость между активностью и концентрацией фермента имеет почти линейный характер. Примером методов второго, автолитического типа является определение так называемого мальтозного числа пшеничной муки. В условиях проведения анализа этого типа лимитирующими факторами являются концентрация фермента, концентрация субстрата или атакуемость субстрата, и выделить отдельно тот или иной фактор не удается. Методы такого рода получили название автолитических потому, что фермент действует на тот субстрат, с которым он встречается в природных условиях.
Амилазы в тесте расщепляют крахмал на декстрины и сбраживаемые сахара. В течение процесса брожения только незначительный процент крахмальных зерен, поврежденных в процессах размола доступен воздействию амилаз. Только в период между началом клейстеризации крахмала в печи и инактивацией амилаз в значительной мере повышается восприимчивость крахмала к амилолитическому распаду.
Амилазы могут действовать на свойства теста тремя путями; путем образования Сахаров, которые могут сбраживаться дрожжами; путем удаления фракций поврежденного крахмала и путем образования декстринов. Образование сбраживаемых Сахаров увеличивает газообразующую силу теста с недостаточным количеством Сахаров. Добавление амилазы к такому тесту дает особенно большие результаты. Однако в том случае, когда в рецептуру входит от 3 до 6% легко сбраживаемой сахарозы, едва ли можно рассчитывать на увеличение газообразующей силы в результате образования не более чем 2% мальтозы. При таких условиях благоприятный эффект от добавления амилазы следует отнести за счет остальных двух процессов.
Распад крахмала и в особенности наличие поврежденных зерен крахмала с высокой гидрофильной способностью, согласно показаниям фаринографа, разжижают тесто. В связи с ограниченным количеством такого крахмала консистенция теста не ухудшается ниже предельной величины, даже в случае добавки альфа-амилазы в особенно значительном количестве. Как и следовало ожидать, чувствительность как газообразующей силы, так и консистенции теста к альфа-амилазе увеличивается при добавлении крахмала, размолотого на шаровой мельнице. Добавление больших количеств альфа-амилазы к тесту из нормальной муки не оказывает вредного влияния на его реологические свойства в течение периода брожения при условии, что имеющиеся протеазы действительно потеряли свою активность. В последнем случае значительные количества альфа — амилазы увеличивают объем хлеба, хотя качество мякиша при этом ухудшается. Газоудерживающая способность теста, в особенности в период расстойки, увеличивается, что обусловливается, вероятно, скорее образованием декстринов, чем исчезновением фракции поврежденных крахмальных зерен.
Распад крахмала после его клейстеризации в пекарной печи зависит от объема и термостабильности имеющихся амилаз. Примерно при 65° нативный крахмал клейстеризуется и становится доступным для воздействия амилаз. Бета-амилаза при этой температуре инактивируется, но пшеничная альфа-амилаза остается активной в течение еще одной или двух минут, до тех пор, пока температура не достигнет 75°. Избыточное количество альфа-амилазы или использование альфа-амилазы, теряющей активность при очень высокой температуре, как, например, бактериальная амилаза, вызывает значительное разжижение и декстринизацию, и как следствие образуется влажный, липкий, тягучий мякиш, который характерен для хлеба из проросшей пшеницы.