Самые первые попытки использования хищных грибов для борьбы с нематодами, которые поражают культурные растения, принадлежат М. Б. Линфорду и его коллегам, работавшим на Гавайских островах незадолго до второй мировой войны.
Объектом опытов служила корневая галловая нематода, повреждающая ананасы и являющаяся злостным вредителем, доставившим много беспокойства владельцам ананасных плантаций в Гавайе. Для избежания перевозок наиболее экономичным считается выращивание ананасов поблизости к консервным заводам; подобная практика часто приводит к непрерывной культуре ананасов на одном и том же поле в течение ряда лет. Таким путем создаются исключительно благоприятные условия для нематод, так как монокультура значительно помогает переносу инфекции с растений одного года на последующие. Создавшееся положение можно до известной степени сравнить с положением в наших собственных картофелеводческих районах, где свирепствует картофельная нематода.
Ананасы являются одной из важнейших культур Гавайских островов. Растение ананаса (Ananas comosus) имеет массивный стебель высотой около 60 см, несущий прямостоячие сочные листья, расположенные в виде розетки. Эти листья сохраняют в себе воду, что позволяет ананасу легко переносить засушливый период, который может вызвать гибель большинства других растений. В Гавайе имеется много тысяч гектаров засушливых земель, на которых можно успешно выращивать только ананасы, для других культур они непригодны; таким образом, монокультура является здесь хозяйственной необходимостью, но она в свою очередь способствует размножению нематод.
У ананасов редко завязываются семена. Для посадки можно использовать три типа материала: розетки — облиственные верхушки плода; черенки, отходящие от цветоносов, и отпрыски, вырастающие из пазух листьев на главном стебле. Когда растения достигают возраста 15—20 месяцев, на верхушке стебля образуется соцветие — побег, несущий группу цветков, напоминающий по окраске лаванду. Отдельные цветки постепенно срастаются между собой и делаются мясистыми и сочными; плод — фактически ложный плод — созревает через 5—6 месяцев после этого.
Если побеги, выходящие из пазух листьев, остаются на растениях, то получается второй урожай ананасов, так называемый первый отпрысковый урожай. Обычно с растений получают один или два отпрысковых урожая, после чего участок перепахивают и высаживают на нем новые розетки плодов, черенки или отпрыски. Если посадку проводят в засушливой местности, почву необходимо покрыть бумажной мульчей — бумагой, пропитанной битумом, с проделанными в ней отверстиями для высадки ананасов из расчета 37 500—50 000 растений на 1 га, такая мульч-бумага не только предупреждает чрезмерно высокие потери воды из почвы в результате испарения, но и подавляет развитие сорняков.
В 1941 г. мировое производство консервированных ананасов составляло 25 млн. ящиков, из которых 21 млн. ящиков дали Гавайские острова.
Линфорд и его коллеги провели интересное обследование естественных врагов нематоды в почве гавайских ананасных плантаций. Они отобрали пробы почвы с плантаций и из садов, зараженных корневой галловой нематодой, и обнаружили не менее 52 видов организмов, поражающих тем или иным путем нематод. Состав их приводится ниже.
Свободноживущие хищные грибы — истребители нематод — 11
Эндозойные хищные грибы — 6
Грибы — паразиты яиц нематод — 1
Простейшие животные, паразиты нематод — 1
Хищные нематоды — 24
Клещи — 6
Хищные тихоходки (Tardigradae) — 3
Список оказался громадным. Некоторые из этих организмов были найдены в песке, вулканическом пепле, лесной подстилке, почве и на различных высотах — примерно до 3000 м над уровнем моря. Некоторые из них встречались в больших количествах в почве, сильно зараженной корневой галловой нематодой; на одном зараженном участке в радиусе 800 м было обнаружено не менее 18 различных видов хищных организмов.
Можно только удивляться, как при наличии столь грозной армии врагов нематоды вообще могут существовать, не говоря уже о том, чтобы наносить серьезные повреждения плантациям ананасов. Численность нематод, несомненно, несколько уменьшилась в результате деятельности их врагов, но так как никаких признаков дальнейшего уменьшения ее нет, то, вероятно, между хищниками и их жертвами установилось естественное равновесие. Совершенно ясно, что при условии практического использования этих охотников за нематодами в широком масштабе придется изыскивать способы повышения их численности или активности, а лучше всего и численности и активности.
В одном из первых опытов Линфорд и его коллеги испытывали влияние добавления хищных грибов, уничтожающих нематод, к почве, зараженной корневой галловой нематодой. Эффективность этого приема они оценивали по результатам выращивания растений ананаса на почве, подвергавшейся различной обработке. В опыте было использовано 6 видов грибов: Dactylella ellipsospora (клейкие головки), Arthrobotrys musiformis (клейкие сети), два различных штамма (изолята) Arthrobotrys oligospora (клейкие сети), Dactylaria thaumasia (клейкие сети) и неопределенный вид Dactylella.
Почва была насыпана в сосуды емкостью 22,5 л. В опыте испытывалось 10 различных вариантов обработки, и в каждом отдельном варианте подвергалось обработке 10 сосудов. Повторности, т. е. использование больше чем одного сосуда в каждом варианте, имели своей целью повышение точности опыта; при одном сосуде на вариант возможны отклонения, вызванные причинами, не имеющими ничего общего с предметом опыта, тогда как средние данные по 10 сосудам будут менее изменчивы и поэтому правильнее отразят фактическое положение. Кроме того, повторность обработок дает возможность применять методы статистического анализа при оценке результатов опыта.
В 8 вариантах почва была искусственно заражена путем добавления к ней личинок корневой галловой нематоды. В 6 вариантах, зараженных нематодами, были добавлены также культуры 6 видов хищных грибов, в сосуды каждого варианта — особый вид. Таким образом, в опыте оставалось 4 варианта, не зараженных грибами, причем 2 из них были заражены нематодами, а 2 других — не заражены. В два из оставшихся вариантов — один с нематодами, другой без них — вносили некоторое количество стерильной питательной среды, применяемой для выращивания грибов; на этой среде никаких грибов не выращивалось, и она использовалась в данном случае только потому, что не исключалась возможность непосредственного воздействия веществ, содержащихся в питательной среде (помимо действия самих грибов) на результаты опыта. В остающиеся 2 варианта не вносили ни питательной среды, ни грибов, хотя почва в них была заражена личинками нематод.
Вариант 1 служит контролем, т. е. остается без всяких обработок в качестве основы для сравнения г вариантами, в которые вносятся грибы. Варианты 2, 3 и 4 также служат контролем. Подобно тому как вариант 1 должен дать представление о росте растений ананаса при отсутствии нематод, так вариант 2 должен показать влияние нематод на растения при отсутствии каких-либо контрмер. Вариант 3 показывает влияние питательной среды на рост растений ананаса: когда культуры грибов добавляют к почве, то вместе с ними вносят и часть питательной среды, и вполне возможно, что она может оказать удобрительное или какое-либо другое влияние на растения; отсюда вытекает необходимость постановки данного варианта (3). Вариант 4 показывает влияние, если оно имеется, питательной среды на вредоносность нематод; возможно, что питательная среда, вносимая вместе с грибами, может усилить или ослабить вред, причиняемый нематодами, и мы должны проверить это положение. Варианты 5—10 говорят сами за себя. Не следует забывать, что каждый вариант был повторен 10 раз, другими словами, в опыте было поставлено 10 серий по 10 сосудов в каждом.
В каждом из сосудов выращивались растения ананаса; опыт длился 15 месяцев. Оценка влияния различных вариантов производилась путем измерения надземной части растений ананаса и общей длины их корней. Во всех сосудах, где почва была заражена личинками нематоды, рост надземной части растений был ослаблен в результате повреждения нематодами. В варианте 2 (где в почву вносили только нематоды) надземная часть была на 40% меньше, чем в варианте 1 (без нематод). В варианте 4 (внесение одной стерильной питательной среды) надземная часть была меньше на 34%, тогда как в варианте 5 (нематоды и Dactylella ellipsospora) она была меньше только на 28%. Уменьшение общей длины корней в результате поражения нематодами в вариантах 2, 4 и 5 составляло 73, 69 и 57% соответственно. Остальные 5 видов грибов, использованные в опыте, по-видимому, никакого влияния не оказывали. Из приведенных цифр видно, что из 6 видов грибов, подвергшихся испытанию, только Dactylella ellipsospora снизила вредо носность нематод, и то в слабой степени. Результаты оказались обескураживающими, но впереди предстояло еще много работы.
Выше уже указывалось, что распространенные в природе хищные грибы в изобилии встречались в почве, зараженной корневой галловой нематодой; поэтому Линфорд обратил теперь свое внимание на возможность разработки способа стимулирования их активности; если бы удалось использовать для борьбы с нематодами грибы, уже имеющиеся в почве, то отпала бы необходимость добавления к ней грибных культур.
Было установлено, что в результате смешивания с почвой свежего зеленого растительного материала численность безвредных свободноживущих нематод резко увеличивалась; так, например, в одном опыте через 14 дней после внесения в почву зеленых растений численность нематод увеличилась в 65 раз по сравнению с исходным количеством. Но через 21 день популяция нематод резко уменьшилась в числе, тогда как хищные грибы в этой же почве достигли обильного развития. По-видимому, усиление активности грибов более чем компенсировало увеличение численности нематод.
В период усиления активности грибов количество личинок нематод, паразитирующих на растениях, уменьшалось. Линфорд провел ряд лабораторных и тепличных опытов с внесением измельченных растений ананаса в почву, естественно зараженную корневой галловой нематодой. Эта серия опытов показала, что в каждом варианте было получено значительное снижение численности личинок паразитических нематод; статистический анализ опытных данных подтвердил достоверность полученных результатов.
Помимо использования в этих опытах измельченных растений ананаса, были проведены такие же опыты с измельченными зелеными листьями злака Panicum barbinoda; внесение их также обеспечило значительное снижение численности личинок корневой галловой нематоды, хотя результаты были получены несколько худшие, чем при использовании растений ананаса.
Эти наблюдения были поистине замечательны, и Линфорд предположил, что они могут объяснить положительные результаты, полученные некоторыми работниками при внесении зеленого удобрения в почвы, зараженные корневой галловой нематодой.
Для получения более точного представления о стимулирующем действии растительного материала на хищные почвенные грибы Линфорд и его сотрудники провели серию опытов по изучению результатов применения различных способов, воздействуя на почву в тщательно регулируемых условиях. В этих опытах почву брали с участка, сильно зараженного корневой галловой нематодой, и помещали в широкогорлые стеклянные банки емкостью 4,5 л. Взвешенные количества испытуемого органического вещества вносились в соответствующие сосуды и тщательно смешивались с почвой путем встряхивания и вращения сосудов.
Пока шел процесс разложения органического вещества, отверстия банок были закрыты муслином; через определенные промежутки времени сосуды с их содержимым взвешивали и потери веса компенсировали путем добавления воды. Вначале вели ежедневную регистрацию температуры почвы, пользуясь для этой цели термометрами, шарики которых помещали в центр поверхности почвы в двух сосудах каждого варианта, но так как в процессе разложения наблюдалось очень слабое согревание, которое быстро проходило, то в дальнейшем от этой процедуры отказались.
Сосуды содержались в одинаковых условиях в течение определенного срока времени, пока шло разложение органического вещества. Затем почву из каждого сосуда вынимали, тщательно перемешивали и, разделив на четыре равные части, насыпали в цветочные вазоны, в которые затем высевали семена коровьего гороха (Vigna sinensis).
Коровий горох служил растением-индикатором, так как этот вид поражается той же корневой галловой нематодой, что и ананас; в вазоне можно значительно быстрее вырастить коровий горох, чем ананасы, а так как растения его гораздо мельче, то в одном вазоне удается вырастить по нескольку экземпляров. Между 30-м и 35-м днями после посева проростки коровьего гороха вынимали из почвы, отмывали их корни и подсчитывали на них число галлов, образованных корневой нематодой.
Для разрешения этого вопроса было поставлено 5 отдельных опытов; каждый из них должен был осветить данную проблему с особой точки зрения.
Опыт 1
В этом опыте испытывались 3 различных органических вещества: сахар, измельченный ананас и измельченные листья грубостебельного злака Panicum barbinode. Для испытания каждого из них было взято по 4 сосуда; кроме того, 4 сосуда, в которые вносили только воду, служили контролем. Таким образом, всего в опыте было использовано 16 сосудов.
Через 10 недель, в течение которых шло разложение органического вещества, через стеклянные стенки сосудов, куда был внесен сахар, можно было увидеть множество нематод; в сосудах с измельченными ананасом и злаком нематод было значительно меньше, а в контрольных их совсем не было. Нематоды принадлежали преимущественно к свободноживущим, непаразитическим видам.
Процесс разложения органического вещества длился в течение 12 недель, после чего почву перенесли в вегетационные сосуды и высеяли в них семена коровьего гороха. Одновременно с этим из всех сосудов были взяты пробы почвы для исследования. Оказалось, что в сосудах трех серий опыта с внесением органического вещества нематоды были гораздо многочисленнее, чем в контроле; из хищных грибов, уничтожающих нематод, были обнаружены 4 различных вида в сериях опытов с внесением ананаса, 3 вида в опытах с внесением злака; в сосудах с внесением сахара и в контроле ни одного вида хищных грибов не было найдено.
При исследовании проростков коровьего гороха, выращенных в почве из различных сосудов, выявились резкие различия в результате разных обработок. На проростках, выращенных на почве, к которой добавлялись ананас и злак, галлов было значительно меньше, чем на контрольных растениях; к сожалению, в опытах с сахаром всходы коровьего гороха погибли вскоре после прорастания, так что в данном случае сравнение оказалось неосуществимым.
В конце опыта почву каждой серии, состоявшей из 4 небольших сосудов, в которых был выращен коровий горох, ссыпали в один более крупный сосуд и высадили в него черенок ананаса. Через 10 месяцев оказалось, что ананасы, выросшие на почве, содержавшей органическое вещество, были развиты значительно лучше контрольных растений как в отношении веса надземной части, так и по протяженности и состоянию их корневых систем.
Опыт 2
В этом опыте изучалось влияние различных количеств измельченного ананаса с целью выяснения вопроса о том, какое количество свежего растительного материала даст наиболее эффективные результаты.
Опыт был поставлен по той же схеме, что и предыдущий, и состоял из 6 вариантов. На каждый вариант было взято 4 сосуда емкостью по 4,5 л, так что всего в опыте участвовало 24 сосуда. В одной серии из 4 сосудов к почве ничего не добавляли, и она служила контролем; в сосуды второй серии добавляли только воду, не внося растительного материала; эти сосуды служили также контролем при уточнении вопроса о том, что определяет описанное выше действие растительного материала — вода, содержащаяся в растениях, или органическое вещество. В сосуды остальных четырех вариантов добавляли измельченные целиком растения ананаса в количестве 100, 200, 300 и 400 г на сосуд.
Таким образом, общая схема опыта имела следующий вид:
1. К почве ничего не добавлялось.
2. Добавление воды без внесения ананаса.
3. Измельченный ананас — 100 г на сосуд.
4. Измельченный ананас — 200 г на сосуд.
5. Измельченный ананас — 300 г на сосуд.
6. Измельченный ананас — 400 г на сосуд.
Как и в первой серии опытов, сосуды были оставлены на 12 недель, в течение которых происходило разложение органического вещества, после чего почву из каждого сосуда распределили поровну между четырьмя более мелкими сосудами и высеяли в них коровий горох.
По прошествии 12 недель из сосудов были взяты пробы почвы, исследование которых показало, что в почве, содержавшей измельченные растения ананаса, нематод было больше, хотя увеличение их численности происходило не прямо пропорционально количеству добавляемого органического вещества. При исследовании проростков коровьего гороха оказалось, что до 300 г на сосуд число галлов корневой нематоды на их корнях прогрессивно уменьшалось по мере увеличения количества органического вещества; но на проростках из варианта с внесением 400 г на сосуд количество галлов во всех случаях было больше, чем на проростках из варианта 300 г на сосуд. Этот факт заставляет предполагать, что существуют определенные оптимальные количества органического вещества, которые не следует превышать, если желательно получить наилучшие результаты. Этот вопрос требует еще дальнейшего изучения, хотя практическое значение его уже сейчас совершенно очевидно.
Что касается двух серий контрольных сосудов, то на корнях коровьего гороха, выращенного в почве с добавлением воды, галлов было меньше, чем на проростках из почвы, в которую ничего не вносили.
Для получения точных данных о том, какие количества органического вещества требуются для получения наиболее высокого защитного действия против нематод, необходимо провести дополнительно многочисленные опыты того же типа. Приведенные здесь лабораторные опыты необходимо подкрепить значительно более широкими полевыми испытаниями. Необходимо исследовать так много различных переменных факторов — климат, тип почвы, род вещества, добавляемого к почве, и т. д., что только очень широкая программа исследовательских работ сможет дать нам определенные ответы на многие поставленные проблемы.
Опыт 3
Во всех опытах этой серии в течение периода разложения органического вещества сосуды время от времени встряхивали и вращали для обеспечения тщательного перемешивания всех составных частей. Целью опыта 3 было выяснение вопроса о том, может ли редкое или частое перемешивание обеспечить лучшие результаты; одновременно предстояло выяснить, существует ли какая-либо разница и если существует, то в чем именно между действием крупно — и мелкоразмельченного растительного материала.
В опыте были использованы две серии сосудов; в одной из них встряхивание производилось еженедельно, во второй — через 3 недели. Каждая серия сосудов была в свою очередь разделена на три группы: в первой из них в почву вносили крупноизмельченный растительный материал; во второй — мелкоизмельченный, а в сосуды третьей группы вообще никакого растительного материала не вносили, они служили контролем.
По окончании периода разложения в сосуды были высеяны, как обычно, семена коровьего гороха, и корни развившихся из них проростков подвергались исследованию на зараженность галловой нематодой.
Исследование корней проростков коровьего гороха показало, что на проростках из сосудов, где в почву органического вещества не вносили, галлов было больше, чем на проростках, выращенных на почве с добавлением измельченного растительного материала. Но при этом было обнаружено, что ни степень измельчения, ни частота перемешивания не обусловили сколько-нибудь значительной разницы между вариантами, хотя и было отмечено, что на растениях коровьего гороха из сосудов, где почву перемешивали еженедельно, развилось меньше галлов, чем на растениях из сосудов, где перемешивание производилось с трехнедельными интервалами.
Этот опыт подтвердил влияние добавления растительного материала к почве, но наряду с этим дал совершенно неопределенные результаты в отношении той основной проблемы, для разрешения которой он был поставлен.
Опыт 4
В этом опыте сравнивалось влияние добавления свежих измельченных растений ананаса и таких же растений, но подвергнутых жаровой сушке перед смешиванием с почвой.
Всего в этом опыте было поставлено 3 серии по 7 сосудов в каждой. В этой серии в каждый сосуд было внесено 300 г измельченных свежих растений ананаса; в сосуды второй серии вносили 63 г высушенного ананаса и 237 г воды; в сосуды третьей серии, служившие контролем, растений ананаса не добавляли. Разложение органического вещества продолжалось 12 недель, сосуды через каждые 14 дней встряхивали и поливали для возмещения потери веса.
В сосудах с сухими растениями ананаса потери в весе в течение первых 14 дней опыта были больше, чем в сосудах со свежими растениями. Эти потери веса включают не только испарившуюся воду, но и газообразные продукты разложения, и более сильное первоначальное снижение веса сосудов, содержавших сухие ананасы, должно означать большую быстроту разложения сухого растительного материала по сравнению со свежим.
Образцы почвы, взятые из сосудов по окончании 12-недельного периода разложения, показали, что в почве, куда добавляли измельченные растения ананаса, личинок корневой галловой нематоды было меньше, чем в почве из контрольных сосудов. Почва без добавления растительной массы содержала 21,3 личинки на 10 г по сравнению с почвой при добавлении свежего растения ананаса, где она содержала одну личинку на 10 2 и 0,3 личинки на 10 г почвы при добавлении высушенных растений. Численность галлов на корнях проростков коровьего гороха из сосудов, где в почву добавлялся растительный материал, была значительно ниже, чем на растениях из контрольных сосудов; в сосудах с добавлением высушенного растения ананаса галлов было несколько меньше, чем в сосудах со свежими растениями.
Этот опыт представляет большой интерес, так как дает не только дополнительные доказательства положительных результатов внесения органического вещества в почву, зараженную корневой галловой нематодой, но и показывает, что высушенный растительный материал может оказаться столь же эффективным, как и свежий. Если эти результаты подтвердятся, они могут иметь очень важное практическое значение.
Опыт 5
В данном опыте была сделана попытка установить, постепенно или сразу происходит уменьшение численности личинок корневой галловой «нематоды после внесения в почву свежего растительного материала. С этой целью были использованы две серии по 6 сосудов в каждой; в первой серии в сосуды было внесено 300 г измельченного свежего растения ананаса, тогда как вторая — без внесения растительного материала — служила контролем. Через каждые 14 дней сосуды встряхивали для перемешивания почвы; одновременно в них добавляли воду для возмещения потери веса.
В начале опыта в контрольной ничем не обработанной почве были выращены растения коровьего гороха для того, чтобы определить интенсивность галлообразования и установить стандарт для сравнения в ходе дальнейшего опыта. Через каждые 4 недели в серию сосудов, из которых часть содержала землю с измельченными растениями, а часть служила контролем, высевали обычным путем коровий горох; таким образом, через 20 недель после начала опыта 5 серий сосудов были засеяны, с месячными интервалами, коровьим горохом. Численность галлов на корнях растений коровьего гороха в этих сосудах сравнивалась с численностью их на растениях, выращенных в исходной почве в начале опыта, что давало возможность определить уменьшение числа личинок корневой галловой нематоды из месяца в месяц.
Было установлено, что, как и раньше, разложение растений ананаса в почве сопровождалось уменьшением численности корневой галловой нематоды, показателем чего служило количество галлов на корнях растений коровьего гороха. В сосудах, куда вносились растения ананаса, меньше всего галлов оказалось на растениях, высеянных через 4 недели после начала опыта; с каждым последующим четырехнедельным периодом число их увеличивалось; в контрольной почве наименьшее число галлов было обнаружено через 8 недель после начала опыта; с течением времени различия между обработанной и контрольной почвой становились все меньше.
Этот опыт дал менее удовлетворительные результаты, чем другие, в связи с изменчивостью данных по повторностям вариантов опыта. На основании их можно предположить, что максимальное влияние разлагающегося растительного материала сказывается относительно быстро и что после этого максимума оно постепенно ослабевает, но для того, чтобы сделать окончательные выводы, необходимо продолжить работу в данном направлении.