Рибофлавин синтезируется многими микроорганизмами: бактериями, дрожжами и грибами.
Наиболее известными продуцентами рибофлавина являются Eremothecium ashbyii, Ashbya gossypii, Clostridium acetonobutilicum, некоторые штаммы Candida и Mycobacterium.
Рибофлавин участвует в процессах переноса водорода в окислительно-восстановительных реакциях, являясь составной частью флавинадениндинуклеотида. Рибофлавин присутствует в культуральной жидкости в свободной форме. В клетках E. ashbyii он встречается в виде флавинадениндинуклеотида и свободного витамина, расположенного в виде желтых кристаллов в вакуолях. Для выращивания Е. ashbyii пригодны глубинный и поверхностный методы. В качестве источников азотного питания используется молочная сыворотка, семена бобовых растений, рыбная мука, кукурузный экстракт, соевая мука и казеин. Из углеводов — глюкоза, сахароза. Очень перспективным и экономически выгодным является применение в качестве основного компонента питательной среды барды пшеничной муки (отходы спиртового брожения). Состав питательной среды и количественные отношения ингредиентов зависят от культуры.
При ферментации Е. ashbyii наблюдаются более или менее близкие закономерности в изменении биохимических показателей культуральной жидкости. В течение 30—40 ч почти полностью расходуются углеводы, после чего отмечается интенсивный синтез и накопление в культуральной жидкости рибофлавина. Накопление рибофлавина в питательной среде совпадает по времени с началом автолиза культуры.
В первые сутки ферментации резко падает pH, но начиная со вторых суток медленно поднимается. Весь процесс продолжается в течение 3—5 суток, при температуре 28—30°. Для нормального хода синтеза рибофлавина необходима хорошая аэрация. На биосинтез рибофлавина угнетающее действие оказывают ионы железа, поэтому их концентрация в среде должна быть тщательно подобрана. В глубинной культуре Е. ashbyii в течение первых двух суток содержание рибофлавина примерно одинаково в мицелии и культуральной жидкости. Начиная с третьих суток преобладающее его количество находится в культуральной жидкости, а содержание в мицелии резко падает. Ненасыщенные жирные кислоты цис-конфигурации стимулируют биосинтез рибофлавина Е. ashbyii в противоположность насыщенным, которые тормозили его или не оказывали вовсе никакого влияния. Для получения флавинадениндинкулеотида биомассу экстрагируют смесью пиридин : метанол : вода (1:3:1) и затем хроматографически очищают от сопутствующих примесей.
Пути биосинтеза молекулы рибофлавина культурами Ashbya gossypii, Eremothecium ashbyii и некоторыми штаммами Candida были изучены с помощью «меченных» по углероду (С14) соединений. Как было установлено, формирование колец В и С происходит по тем же путям, по которым идет синтез пуриновых оснований, таких, как аденин, ксантин и гуанин. Весьма вероятно, что непосредственным предшественником этих колец является диаминоурацил, образующийся из ксантина в результате отщепления углеродного атома (С-8). Полагают, что ксантин может образовываться из аденина и гуанина.
Как известно, пуриновые основания аденин и гуанин входят в состав нуклеиновых кислот. Существует точка зрения, что усиленный синтез культурой рибофлавина является результатом избыточного образования пуринов. Возможно, что, наряду с аденином и гуанином, образуются пока неидентифицированные их дериваты, которые обеспечивают биосинтез молекулы рибофлавина; или аденин и гуанин сами превращаются в ксантин в результате энзиматических реакций.
В исследованиях с «меченой» глюкозой, целью которых было установить закономерности биосинтеза кольца А, было показано, что глюкоза превращается путем анаэробного гликолиза до пировиноградной кислоты. В случае биосинтеза кольца А последняя не декарбоксилируется с образованием ацетата. Из пировиноградной кислоты образуется ацетальдегид, который затем может реагировать с другими молекулами пировиноградной кислоты с образованием ацетоина.
Ацетоин последовательно присоединяется сначала к производному диаминоурацила (5-амино-4-рибитиламиноурацил) с образованием 6,7-диметил-8-рибитиллумазина, а затем к названному веществу с образованием рибофлавина. Возможно, что, кроме ацетоина, в реакцию образования кольца А вступает диацетил.
Химический (не ферментативный) путь превращения 6,7-диметил-8-рибитиллумазина начинается с разрыва пиразинового кольца с последующей альдольной конденсацией двух молекул в димерный биацетил и циклизацией его в рибофлавин. На каком этапе биосинтеза молекулы рибофлавина включается боковая цепь, содержащая рибитол, пока не установлено.