Биотехнология лежит в основе следующих методов: применение трансгенных растений, регенерантов, полученных путем перенесения гена устойчивости или заданного необходимого свойства, например внесение токсигенных веществ в геном растения или микроорганизма с помощью генной инженерии;
использование микробных антагонистов в период, предшествующий проникновению фитопатогена в растения; применение гиперпаразитоЕ после инфекции; иммунизация с помощью инокуляции растений авирулентными или гиповирулентными (ослабленными) штаммами; применение антибиотиков (биофунгицидов), являющихся продуктами микроорганизмов, растений и других живых объектов, а также клеток или их частей (ферментов). Хотя эти приемы в настоящее время используются мало, в перспективе ожидается более интенсивное их развитие. Получен штамм К1026 рекомбинацией ДНК штамма К84 Agrobacerium radiobacer, который зарегистрирован в Австралии для защиты от бактериозов плодовых.
Антагонизм может быть обусловлен аллелопатией, или антибиозом, основанным на выделении антагонистами микотоксинов, имеющих антибиотические свойства. Продуцируемые антагонистами антибиотики угнетают возбудителей болезней. О перспективности использования антагонистов и их продуцентов говорит тот факт, что организацией Plan Geneic sysems (Гент, Бельгия) из почвы, ризосферы и филлосферы различных растений выделено и идентифицировано с помощью SAS PAGE около 2800 антигрибных бактериальных изолятов, в том числе P. fluorescens — 760 штаммов, Xanhomonas malophilia — 550, Bacillus sp. — 115 и Phyllobacerium sp.- 110 штаммов (Leyns e. a., 1988). Антагонисты эффективны только при применении их до заражения. В этот период необходимо создать устойчивую антагонистическую микрофлору (Fokkema, 1988).
Гиперпаразитизм, или сверхпаразитизм, также основан на микробном антагонизме. Известны микопаразиты биотрофные, которые обитают только на живых клетках грибов и отличаются высокой селективностью, и некротрофные. Биотрофные микопаразиты менее пригодны для непосредственного использования в качестве средств защиты, так как они, как правило, не культивируются на обычных питательных средах в отсутствие хозяина, а в природных условиях только тормозят патогенез возбудителя, но не вызывают его быстрой гибели. Тем не менее, их роль весьма важна и при использовании соответствующих элементов интегрированной защиты можно поддерживать жизнедеятельность биотрофов на достаточном уровне, с тем, чтобы сократить применение фунгицидов.
Некротрофные микопаразиты более пригодны для использования, так как они могут нарабатываться на искусственных питательных средах; можно также получать в промышленных масштабах их активные продукты — антимикробные вещества (антибиотики). Некротрофные гиперпаразиты должны использоваться сразу после заражения при низкой степени развития болезни, так как для их паразитизма необходимы соответствующие гидротермические условия. Активность можно усилить добавочной инокуляцией.
Разработка биопрепаратов до регистрации проходит следующие этапы: изолирование, идентификация, изучение физиологии и патогенности, селектирование штаммов, изучение их взаимодействия с биотическими и абиотическими факторами, наработка биопрепаратов, их стандартизация, контроль за качеством и стабильностью, испытание в лабораторных и полевых условиях, определение надежности в разных условиях.
Иммунизация растений путем инокуляции их авирулентными или гиповирулентными штаммами приобретает все большее значение. Необходимые штаммы выделяют из природных объектов или получают искусственно, воздействуя на нормальные вирулентные штаммы физико-химическими и другими методами.
Под влиянием ослабленных по патогенности штаммов растение вырабатывает фитоалексины и другие биологически активные вещества. Так происходит, например, при использовании авирулентной расы Phyophhora infesans на картофеле (Ellis е. а., 1988). При иммунизации растений табака ослабленными штаммами возбудителя пероноспороза в растениях накапливались фитоалексины и полимеры, а также возрастала активность пероксидазы, хитиназы, линоксигеназы, увеличивался уровень ингибиторов протеазы (Кис, 1988), в результате устойчивость растений возрастала.
Иммунизация растений непатогенными штаммами Fusarium охуporum в полевых условиях была равноценна применению беномила (Ogawa, Komada, 1988). Этот прием защищает баклажан и томат не только от фузариозного, но и от вертициллезного увядания, т. е. проявляется множественное индуцирование устойчивости (Yamaguchi е. а., 1988). При использовании гиповирулентного штамма Rhizocionia solani для защиты от вирулентных штаммов этого гриба фитоалексины не образуются, а происходит конкуренция за приоритет заражения. Защитное действие объясняется также увеличением содержания Са2+ в прединокулированных растениях (Sneh, Ichielevich, 1988). Применение авирулентных и гиповирулентных штаммов создает благоприятные условия для развития антагонистов вредных организмов.
Подавляющее большинство современных фунгицидов малотоксично для теплокровных животных. Тем не менее их можно рассматривать в качестве одного из источников загрязнения окружающей среды. Необходим поиск новых веществ с высокой селективностью и способностью быстро разрушаться в окружающей среде, в частности антибиотиков, или биофунгицидов, получаемых на основе природных веществ с помощью биотехнологии.
Несмотря на то, что первый антибиотик выделен из Bacillus руосуаneas в конце прошлого века, в сельскохозяйственной практике их стали применять сравнительно недавно. Первоначально для защиты растений использовали антибиотики, разработанные для медицины. Считается, что применение таких антибиотиков в сельском хозяйстве обостряет проблему резистентности к ним возбудителей заболеваний человека.
Первыми из предложенных специально для сельского хозяйства антибиотиков были бластицидин S, затем касугамицин, полиоксины и валидомицин. В настоящее время они нашли свое место в ассортименте средств защиты растений в Японии, Корее, Южной Африке (Sisao, 1984).
При разработке и использовании антибиотиков возникают трудности, связанные, во-первых, с проведением их микроанализов, особенно в тех случаях, когда они содержат ряд компонентов, во — вторых, с быстрым возникновением резистентных форм фитопатогенов. Поэтому биофунгициды необходимо применять вместе с синтетическими фунгицидами в баковых смесях или чередовать их на протяжении сезона. Благодаря этим приемам была быстро снижена резистентность Pyricularia oryzae к касугамицину и объем применения этого антибиотика не сократился (Miura, Takahaschi, 1976). Существуют проблемы и с разрешением на использование антибиотиков органами здравоохранения из-за опасности привыкания к ним людей, хотя надо отметить, что медицинские антибиотики имеют иной механизм действия.
Интерес представляют фунгицидные вещества растительного происхождения. Они содержатся в здоровых растениях, а также образуются в пораженных тканях под воздействием пониженных температур, различных химикатов и механических повреждений.
В высших растениях антигрибные вещества содержатся в форме алкалоидов, или прогибиторов. Из здоровых растений выделены и идентифицированы капиллин, вайрон, хумолон, лупилон, куркумин, гемиковая и гемениковая кислоты, 6 — гексенолактон (парасорбиковая кислота), протоанемонин (зыделен из многих растений сем. Ranuncu — laceae), катехол и протокатеховая кислота (из внешних чешуй лука, корни лука содержат диаллилдисульфид, который провоцирует прорастание склероциев возбудителя белой гнили лука в отсутствие хозяина), флоретин, пиносильвин, хлорогениковая кислота, юглон, плюмбагин, 2-метокси-1,4-нафтахинон, танины: катехол, пирогаллол, галликовая кислота; канаванин, томатин, соланин, бензоксазолинон и др. Экстракты неидентифицированных веществ из корневищ многолетних растений Acorum calamus, Zingiber zirumbe и Curcuma longa проявили фунгитоксичность на уровне беномила или выше (Bandara, Wijayagunasekera, 1988). В монографии (Grainge, Ahmed, 1988) приведены характеристики, классификация, условия произрастания около 2400 растений, экстракты из которых могут быть использованы для защиты растений.
К фунгитоксичным веществам, выделенным из пораженных растительных тканей, относятся орхинол, пизатин, кумарин, или скопулетин, хлорогениковая кислота, ипомеамарон, оризалексины, сандаракопимарадиены.
В неинфицированных растениях, находящихся в абнормальных условиях (пониженные температуры, механические повреждения, воздействие химических соединений или УФ-облучение), накапливаются следующие антигрибные вещества: производные изокумарина, орхинол, хлорогениковая кислота и другие фенолы, кумарин, умбеллиферон, оризалексины и др.
Многие из перечисленных веществ обладают фунгицидностью, а также повышают устойчивость растений. К последним относятся фенольные соединения. Так, устойчивые к фитофторозу сорта картофеля содержат повышенные количества ортодифенолов. Большие количества фенолов обнаруживаются в сортах пшеницы, устойчивых к стеблевой и бурой ржавчинам, а также растениях риса, устойчивых к пирикуляриозу. Наличие катехола и протокатеховой кислоты в луке обусловливает его невосприимчивость к антракнозу. Присутствие хлорогениковой кислоты повышает устойчивость картофеля к фитофторозу, парше, увяданию и кофейного дерева к раку. Способны повышать устойчивость растений танины, томатин и некоторые другие вещества.
Одинаковые фунгитоксиканты нередко накапливаются в растениях под влиянием различных факторов. Так, пизатин в горохе образуется в результате поражения его аскохитозом, обработки сулемой и другими химикатами. Хлорогениковая кислота в картофеле аккумулируется под воздействием фитофтороза, механических повреждений и пониженных температур. К веществам, которые образуются в растениях под влиянием различных факторов, относятся также орхинол, скопулетин, ипомеамарон.
В настоящее время фитоалексины классифицируют как истинные, псевдо — и ложные. Истинные фитоалексины образуются только под воздействием гриба. Химическая структура некоторых антибиотиков до сих пор не установлена.