Низкие температуры используют для предотвращения или задержки биохимических изменений, которые способствуют старению и разрушению клеток во время хранения их при температуре выше нуля.
В связи с этим возникает следующий вопрос: удастся ли нам добиться этой цели при консервации эритроцитов? Вполне вероятно, что применение среды с высокой концентрацией глицерина будет тормозить нормальные метаболические процессы в клетках до и после оттаивания. Причины возникновения гемолиза и утраты жизнеспособности эритроцитами, хранившимися в определенных условиях, можно выявить только в результате специальных биохимических исследований. Возникает также настоятельная необходимость в разработке какого-нибудь лабораторного метода определения потенциальной жизнеспособности эритроцитов in vivo перед переливанием крови.
Гликолиз. При хранении крови в стандартном кислом цитратно-декстрозном растворе при + 4° глюкоза исчезает со скоростью около 0,4 ммоль на 1 л эритроцитов в день.
При температуре +38 или +4°, когда эритроциты взвешены в средах, содержащих 1,0—4,0 М глицерин, гликолиз почти не нарушается. Если же концентрация глицерина превышает 5,0 М, гликолитические процессы подавляются, а при 6,0 М и выше они фактически полностью прекращаются. Предотвращение гликолиза способствует переживанию эритроцитов in vitro, но клетки, подвергшиеся воздействию 5,0 и 6,0 М глицерина, не выживают после переливания.
Когда эритроциты выдерживали при температуре — 20° в нейтральных или подкисленных средах, содержащих 2—4 М глицерин, скорость гликолиза понижалась до 0,005 ммоль глюкозы на 1 л эритроцитов в день. Скорость исчезновения глюкозы понижалась в 80 раз по сравнению со скоростью, наблюдавшейся при +4°. Продолжительность жизни клеток, согретых после хранения при температуре —20°, была в 18 раз больше по сравнению с длительностью жизни клеток, хранившихся при + 4°. Все сказанное говорит о том, что интенсивность гликолиза не может служить показателем для определения потенциальной жизнеспособности клеток и что на разрушение клеток при температуре —20° влияют какие-то другие процессы.
Аденозинтрифосфат и другие органические фосфаты. Аденозинтрифосфат (АТФ) нужен для фосфорилирования глюкозы эритроцитами. Повреждение клеток, хранившихся при +4°, начинается с того момента, когда разрушение АТФ превалирует над синтезом, и становится необратимым, когда содержание АТФ падает ниже определенного уровня. До достижения этого критического уровня нормальное состояние клеток можно восстановить путем добавления аденозина.
В какой же степени распад клеток во время хранения при температуре —20° связан с потерей АТФ? В тех случаях, когда эритроциты хранили при —20° в средах с примесью примерно 3,0 М глицерина, содержание АТФ снижалось медленно и через 1,5 года составляло приблизительно 50% нормальной величины. Между содержанием АТФ в эритроцитах и их жизнеспособностью существовала определенная корреляция, о которой можно было судить по проценту клеток, остававшихся живыми спустя 24 час после переливания. Когда эритроциты перед переливанием инкубировали с аденозином, содержание в них АТФ значительно повысилось. Вместе с тем выживаемость увеличилась в меньшей степени, чем можно было ожидать, судя по результатам, полученным на клетках, хранившихся при + 4°. Содержание АТФ в эритроцитах, хранившихся в 4,5 М растворе глицерина при — 45°, снижалось очень медленно: в период между 4-м и 10-м месяцами консервации наблюдались лишь очень незначительные изменения. Когда же эритроциты взвешивали в среде с примесью 7,0 М глицерина при —45°, содержание АТФ в них, очень быстро достигало низкого уровня, но при длительном хранении при этой температуре изменения в клетках были незначительными. При непродолжительном хранении длительность жизни после переливания сильно уменьшалась и мало изменялась при продолжительном хранении.
Когда эритроциты обрабатывали растворами с концентрацией глицерина выше 6,0 М при температуре +20 или +37°, содержание АТФ быстро понижалось. Возможно, это было частично обусловлено подавлением гликолиза, который имеет существенное значение для поддержания содержания АТФ на определенном уровне. Выживаемость эритроцитов спустя 24 час после переливания уменьшалась, даже если содержание АТФ нормализовали путем введения аденозина.
Результаты этих опытов представляют определенный интерес, поскольку, они показывают, что выживаемость эритроцитов после переливания в некоторой степени зависит от содержания в них АТФ. Кроме того, они показывают, что во время хранения при низких температурах происходят и такие повреждения биохимических систем, которые не имеют отношения к энергетическому обмену в условиях нормальной температуры.
Исчезновение калия во время хранения. Чаплин и др. изучали исчезновение калия из эритроцитов, хранившихся при температуре от —20 до — 45° в течение различных периодов времени (до двух лет) в средах, содержащих 30% глицерина и цитрат натрия или калия. В течение первых 6 недель хранения в незабуференных растворах исчезало 70% внутриклеточного калия. Исчезновение калия значительно усиливалось, когда незабуференные взвеси перед замораживанием насыщали кислородом. Вредящее действие кислорода можно было устранить с помощью таких антиоксидантов, как гидрохинон или аскорбиновая кислота, или же путем добавления буферной системы, поддерживающей pH почти на нейтральном уровне. Чаплин и сотрудники нашли, что и гемолиз, и исчезновение калия были значительно слабее во время хранения при температуре —45°, но клетки все же постепенно разрушались. Эти исследователи считают, что предельный срок эффективного хранения эритроцитов при —45° составляет пять лет. Исчезновение внутриклеточного калия должно отражать изменения в проницаемости оболочки эритроцитов. Эти изменения изучали с помощью физико-химических методов.