В 30-х годах нашего столетия крупнейший американский ученый биохимик Стенли, удостоенный Нобелевской премии за работы в области вирусологии, занялся исследованием химических свойств уже знакомого нам вируса табачной мозаики.
Естественно, чтобы исследовать химические свойства какого-либо соединения, необходимо получить это соединение в очищенном виде и притом в достаточно большом количестве — практически в граммах. Сейчас биохимики могли бы обойтись и меньшим количеством, но в те годы техника эксперимента и анализа была куда примитивнее и требовала много вирусного материала.
Титанический характер этой задачи легко себе представить, если знать, что один вирус весит 0,0000000000000001 грамма. Иными словами, 1 грамм составляет 1016 вирусов. Астрономическая цифра, не правда ли? Но Стенли удалось все же получить такое количество вирусной массы и очистить ее теми методами, которые применяются для очистки белковых веществ. К удивлению ученого, концентрированный раствор очищенного вируса табачной мозаики закристаллизовался! В пробирке образовались кристаллы, правда, не совсем такие, какие, скажем, дает при стоянии на холоде насыщенный раствор сахарозы (обычный сахарный песок) или поваренной соли, но все же кристаллы. Их можно было видеть под обычным микроскопом, и каждый состоял из миллиардов вирусов.
Мы привыкли к тому, что кристаллы способны образовывать лишь различные органические и неорганические вещества. Но кристаллы вируса, полученные Стенли, оказались живыми — после растворения они заражали растения табака, как и исходный некристаллический вирус.
О чем говорит химику способность вируса кристаллизоваться? Прежде всего, о высокой, почти геометрической правильности формы вируса и большой простоте его химического строения. Так подумал и Стенли.
Забегая вперед, скажем, что Стенли оказался прав в своем первом предположении. Через полтора десятка лет, когда вирус табачной мозаики рассмотрели в электронный микроскоп, то увидели частицы очень правильной палочковидной формы. Однако ученый был не совсем прав во второй части своих выводов, когда по данным химических анализов счел вирус табачной мозаики простым белковым веществом (глобулином). Позднейшие работы ученых исправили ошибку Стенли и показали, что в действительности в состав вируса табачной мозаики помимо белка входит еще и нуклеиновая кислота.
Кроме этих двух соединений, в составе вируса табачной мозаики не было обнаружено ни одного из веществ, присутствующих в высокоорганизованных клетках. Вирус был лишен и какой бы то ни было ферментативной активности. (О том, что такое ферментативная активность, вы прочтете в статье «От нуклеиновых кислот до белков»).
Сообщение Стенли вызвало огромный интерес. В области вирусологии начались интенсивные исследования. В результате за одно десятилетие было обследовано множество вирусов.
Часть из них (но далеко не все) удалось получить в кристаллической форме. И здесь выявилась одна общая закономерность, которая, по мере того как анализируются все новые виды вирусов, находит себе дальнейшее подтверждение. Все без исключения вирусы, от самых простых до самых сложных, содержат непременно два вещества: белок и нуклеиновую кислоту (рибонуклеиновую — РНК или дезоксирибонуклеиновую — ДНК). Самые простые вирусы, а таких большинство, и к ним, в частности, относится вирус табачной мозаики, содержат только эти два соединения. В состав более сложных вирусов входят и другие органические соединения типа жиров (липоидов) и углеводов.
Химическое соединение белка с нуклеиновой кислотой (РНК или ДНК) называется нуклеопротеидом (протеин — это второе название белка). Итак, все без исключения вирусы по своей природе либо простые, либо сложные нуклеопротеиды. Никто никогда не обнаруживал вирусов, состоящих только из белка или только из нуклеиновой кислоты.
А теперь сопоставим вывод, который мы сделали при исследовании общих биологических свойств вирусов, с только что установленными результатами их химического анализа. Напомним, вирусы — это простейшая форма жизни, лишенная в покоящемся состоянии обмена веществ и способности к размножению, но несущая в себе все генетические свойства (то есть обладающая наследственностью и изменчивостью). Но ведь состав вируса известен — это два вещества, соединенных в молекулу нуклеопротеида. Следовательно, нуклеопротеид и является элементарной, простейшей формой жизни!
И здесь в руки ученых-биологов попал благодатнейший объект. С одной стороны, жизнь в самом простом, самом элементарном ее проявлении, а с другой — максимально возможная простота химического состава.
Однако следует оговориться: эта простота кажущаяся. Прежде чем прийти к ней, ученые проделали длинный тернистый путь неудач, ошибок и блужданий. Простота и ясность понимания природы вируса пришла лишь через три десятилетия напряженнейшей работы биохимиков, вирусологов и биофизиков всего мира.
А теперь вернемся во времена Стенли. Тридцатые годы были торжеством химии белка, годами интенсивного неуспешного исследования физических и физико-химических свойств белковых молекул. Химия нуклеиновых кислот в то время находилась лишь в зачатке, а сколь-либо серьезно этим классом малоизвестных соединений занималось лишь несколько человек во всем мире.
Под влиянием триумфальных успехов белковой химии, а также из-за первоначальной ошибки Стенли основное внимание было уделено белковой части вирусов, а о второй составной их части — нуклеиновой кислоте — временно забыли.. Эта ошибка была тем более простительна, что все первые работы по химии вирусов были выполнены на вирусе табачной мозаики, который на 94% состоит из белка и лишь на 6% из РНК. Как часто и в жизни мы впадаем в подобную ошибку, считая, что самое главное должно быть представлено в наибольшем количестве!
Стенли в Америке, П. А. Агатов в СССР и Шрамм в Германии почти одновременно проделали серию сходных опытов по химическому видоизменению белка вируса табачной мозаики. Оказалось, что удаление части вирусного белка и присоединение к аминокислотам, входящим в его состав, различных химических веществ не изменяет свойств вируса. Например, вирус табачной мозаики, к которому было присоединено по весу до 6% посторонних химических веществ, обладал такой же инфекционностью, как и исходный, необработанный вирус. Более того, потомство такого видоизмененного вируса оказывалось вполне нормальным!
Результаты этих опытов, странные и непонятные в то время, могли означать только одно: белок вируса табачной мозаики не играет существенной роли в биологических свойствах вируса и, в частности, совершенно не связан с его генетическими — наследственными — свойствами.
В самом деле, в молекуле белка вируса табачной мозаики последняя, концевая аминокислота — треонин. Всего в состав одного вируса входит около 3 тысяч таких концевых треонинов. И всех их до одного можно удалить химическим путем (что уменьшит вес вируса приблизительно на 0,5%), но такой вирус все-таки будет инфекционным! А самое главное, вирусное потомство таких «бестреониновых» родителей содержит совершенно нормальное количество концевого треонина.
Значит, наследственные свойства вируса табачной мозаики, определяющие, в частности, и количество концевого треонина, связаны не с белком, а с каким-то другим компонентом вируса. Но другого компонента, кроме нуклеиновой кислоты, в составе вируса табачной мозаики нет. Следовательно…
Мы недаром поставили многоточие в конце предыдущей фразы. Это многоточие расставило само время и вся логика развития науки. Никто в 30-х годах не осмелился поставить знак равенства между наследственностью вирусных частиц и мало кому известной нуклеиновой кислотой. И поэтому за «следовательно» ничего не последовало. Не последовало вплоть до середины 50-х годов…
Но это было уже другое время. Исследованием химии, физики и биологии нуклеиновых кислот начали заниматься самые видные ученые. Были разработаны точные количественные методы анализа этих соединений. Появились первые доказательства того, что нуклеиновые кислоты как-то связаны с явлениями наследственности и изменчивости. Кроме того, биохимики всерьез заинтересовались вирусами бактерий — фагами, а они оказались более подходящими для исследования роли нуклеиновых кислот. К тому времени вирусологи научились получать большие количества очищенного бактериофага и успели убедиться, что он также нуклеопротеид. Только бактериофаг кишечной палочки, в отличие от вируса табачной мозаики, содержит всего 50% белка, а остальные 50% его веса составляет нуклеиновая кислота (ДНК).
Возобновив поиски активного начала в вирусных частицах, два американских ученых — Херши и Чейз сумели ввести в белок фага один радиоактивный изотоп, а в его нуклеиновую кислоту — второй. Белок фага был ««отмечен» радиоактивной серой, а ДНК — радиоактивным фосфором. И оказалось, что при заражении бактериальных клеток фагом 98-процентной радиоактивной серы основная масса белка в клетку не проникает, остается снаружи, тогда как весь радиоактивный фосфор и, следовательно, вся нуклеиновая кислота родительского фага переходит в зараженную клетку и затем передается по наследству фаговому потомству! Иными словами, вирус перед проникновением в клетку опорожняет свой белковый футляр и вводит его содержимое — нуклеиновую кислоту — в заражаемый объект.
Вот теперь мы можем дописать фразу, оставшуюся незаконченной. Следовательно, активное начало вирусов, их генетические свойства связаны с нуклеиновой кислотой, которая одна проникает в заражаемую клетку.
Описанные здесь опыты Херши и Чейза вновь привлекли пристальное внимание ученых всего мира к вирусам, но на этот раз к их второму компоненту — нуклеиновой кислоте. Дальнейшие события не заставили себя ждать. Ученые снова обратились к вирусу табачной мозаики, так как сравнительная простота методов его очистки и возможность получения большого количества вирусной массы делали его удобным для исследования.
В 1956 году Френкель-Конрат в США и Шрамм в Германии почти одновременно обнаружили, что «остатки» вируса табачной мозаики после разрушения самой вирусной частицы все же обладали инфекционными свойствами. При этом надо иметь в виду, что вирус разрушали с помощью химических веществ, действующих на белок, но не повреждающих нуклеиновую кислоту.
Не правда ли, это до некоторой степени сходно с уже описанными опытами Агатова, Стенли и Шрамма? Только Френкель-Конрат и Шрамм не видоизменяли, а разрушали вирусную частицу. На этот раз ученые не остановились на половине дороги, а сделали следующий, вполне логичный шаг. Они не только разрушили белковую оболочку вирусной частицы, но полностью удалили белок, получив таким образом чистую РНК. Сделать это нетрудно. Достаточно энергично встряхивать раствор вируса с каким-либо веществом (например, фенолом), разрушающим белок. Тогда разрушенный белок выпадет в осадок, а неповрежденная нуклеиновая кислота останется в растворе.
Этим раствором чистой нуклеиновой кислоты заразили листья табака, как их обычно заражали цельным вирусом табачной мозаики. Прошло несколько томительных дней ожидания, и… вы, конечно, догадываетесь — растения табака заболели, заболели самой настоящей мозаичной болезнью! Вирус, который был выделен у заболевших растений, оказался подлинным вирусом табачной мозаики.
Эти эксперименты повторялись не один десяток раз, повторялись придирчиво и строго. Но результат был неизменно один и тот же: химически чистое вещество — нуклеиновая кислота вируса, которое можно осаждать, взвешивать, замораживать, видеть в электронном микроскопе и точно охарактеризовать по ряду физических и химических, свойств, оказалось живым! Было от чего закружиться самым хладнокровным головам, хотя они были подготовлены к этому всей логикой развития событий. Действительно, если в опытах Херши и Чейза с бактериофагом вирус сам распадался на нуклеиновую кислоту и белок на поверхности клетки и в клетку попадала только его нуклеиновая кислота, то в опытах Шрамма и Френкель-Конрата эту работу выполнили умелые руки биохимиков. Вирусу уже не надо было раздеваться самому — в клетку сразу же попадала чистая нуклеиновая кислота.
При этом растения, зараженные нуклеиновой кислотой, заболевали раньше, чем при заражении цельным вирусом. Эта разница во времени как раз соответствовала тому периоду, за который вирусная РНК освобождается («раздевается») от своей белковой оболочки при заражении цельным вирусом. Более того, если вирус, например, нагреть до температуры 70—80°, он теряет свою инфекционную способность. Теряет потому, что белок, утративший после нагревания естественные свойства, не освобождает при контакте с клеткой нуклеиновую кислоту. Но из такого, казалось бы, убитого вируса можно снова получить инфекционную нуклеиновую кислоту, если разрушить и удалить белок искусственно.
Одно было плохо во всех этих опытах. Инфекционность чистой нуклеиновой кислоты неизменно оказывалась во много раз слабее, чем цельного вируса. Почему? До конца это не выяснено и по сей день, но кое-что установить удалось. Ведь у природы есть великолепное средство — естественный отбор, с помощью которого она быстро уничтожает все свои неудавшиеся творения. А свободных нуклеиновых кислот в природе не существует. В вирусах они всегда соединены с белком, образуя (прочный нуклеопротеид. Белок служит как бы футляром, который предохраняет самую важную, но очень хрупкую составную часть вируса — нуклеиновую кислоту — от неблагоприятных воздействий среды. Эта «одежда» помогает нуклеиновой кислоте и при взаимодействии ее с клеткой, хотя позже белковый футляр и остается снаружи. В чем состоит эта помощь, мы пока в деталях не знаем, но суть ее сводится к защите нуклеиновой кислоты.
А уж если разрушить саму нуклеиновую кислоту, то здесь не поможет никакой белок! Сделать это очень просто. Можно воздействовать на вирусы ультрафиолетовым светом или лучами Рентгена, которые повреждают только нуклеиновую кислоту, но совершенно не влияют на свойства вирусного белка. Такие вирусы, совершенно нормальные по внешнему виду, тем не менее не вызывают заражения, даже если их вводить в клетку в стократном избытке. Естественно, что и нуклеиновая кислота, выделенная из таких вирусов, также неинфекционна.
Инфекционные РНК и ДНК удалось выделить из многих вирусов растений, животных и бактериофагов. Сейчас число их уже перевалило за три десятка. Значит, ошибка тут совершенно исключена.
Так оказалась решенной большая загадка маленьких частиц. Все генетические свойства вирусов — их наследственность и изменчивость — определяются нуклеиновой кислотой: либо РНК, либо ДНК. Более того, чистая нуклеиновая кислота оказалась способной заразить чувствительный организм, вызвать в нем те изменения, которые необходимы для успешного синтеза вирусного белка и самой нуклеиновой кислоты.
Но ведь мы с вами взялись за исследование вирусов не в качестве самоцели, а для того, чтобы исследовать свойства и функции живого в самом простом проявлении, где они не усложняются различными побочными процессами. Следовательно, мы можем сделать вывод, что генетические свойства всего живого, всех живых объектов, как простых, так и сложных, определяются нуклеиновыми кислотами. Сведения о генетической роли нуклеиновых кислот в более сложных биологических образованиях вы можете найти в других главах этой книги.
Но как же быть с белком? В покоящихся формах вируса, в состоянии вироспоры, белок, как мы видели, выполняет защитные функции, сохраняя и стабилизируя ядро вируса — его нуклеиновую кислоту. Эта защитная функция белка, по-видимому, имеет место и на ранних стадиях заражения, непосредственно перед освобождением нуклеиновой кислоты из белкового футляра. Но белковый футляр не просто безличная «упаковка» для нуклеиновой кислоты. Белок и нуклеиновая кислота точно соответствуют по форме, размерам и другим внутренним деталям структуры друг другу. Более того, тот факт, что вирус определенного вида поражает только определенные виды организмов, определяется белком. Иными словами, специфичность взаимодействия вируса с клеткой зависит от его белка.
Удалось доказать, что нуклеиновая кислота, выделенная из вируса полиомиелита, заражает значительно больше видов клеток, чем цельный вирус. Ограничивает ее белковый футляр, благодаря особенностям которого она не в состоянии освободиться от своей «одежды» при взаимодействии с любой клеткой. Конечно, это не означает, что «свободная» нуклеиновая кислота способна поражать все виды животных.
Взаимодействие вируса с клеткой можно сравнить со взаимодействием ключа и замка. Не всякий ключ подходит к любому замку, и не всякий вирус в силу особенностей своего белкового футляра может проникать в любую клетку. Но после того как «клеточный замок» открылся, в клетку входит нуклеиновая кислота вируса.