Нам известно, что уже античные ученые пытались изучать свечение животных.
Значит, исследования биолюминесценции насчитывают не менее 2 тыс. лет. Конечно, эти исследования были чисто случайными.
Древнеримский натуралист Плиний обстоятельно описывал явление свечения улиток: «К роду улиток принадлежат дактили… Они имеют свойство в темноте при отсутствии освещения светиться синим светом, тем сильнее, чем больше влаги они содержат; они светятся во рту, когда их ешь, светятся в руках, и даже на полу и на одежде получается свет от падающих капель. Таким образом, обнаруживается, что природа сока такая же, как и та, которую мы видим в их теле».
Великий мыслитель древнего мира энциклопедист Аристотель также отмечал в своих трудах, что некоторые предметы, например, грибы, мясо, голова, чешуя и глаза рыб, светятся в темноте.
Хотя античные авторы коснулись биолюминесценции лишь вкратце, их наблюдения были весьма точными. Ни Аристотель, ни Плиний не впали в обычную даже для нашего времени ошибку и не приписывали явление холодного свечения неорганическим веществам. Даже говоря о падающей на пол жидкости Плиний связывает ее свечение с процессами, происходящими в организме улитки.
Издавна привлекало внимание ученых также свечение гнилого мяса и рыбы. Знаменитый алхимик и врач средневековья Парацельс описал свечение ран в темноте. Парацельс считал, что светящиеся раны заживают быстрее несветящихся.
Разрозненные сведения о живом свечении, содержащиеся в работах древних и средневековых натуралистов, не составляли еще науки. Все заключения были основаны лишь на пассивном наблюдении. В современном же понимании наука — это исследование, проводимое по заранее намеченному плану, использующее специально поставленные эксперименты.
Наука о биолюминесценции родилась 300 лет назад.
Первую книгу, посвященную специально биолюминесценции, издал в 1655 г. в Цюрихе Конрад Гезнер. В это же время современник Ньютона выдающийся физик-экспериментатор Роберт Бойль занялся изучением живого свечения. Его работы можно назвать первыми серьезными научными исследованиями в этой области.
Бойль был одним из основателей и президентом прославленного Королевского общества наук, поставившего своей целью всестороннее изучение природы. Он обладал критическим умом, умел блестяще делать логические выводы из своих искусно поставленных опытов. Круг вопросов, которыми интересовался Бойль, был очень широк: он занимался исследованиями газов, кипения воды в разреженном воздухе, развития тепла при трении и гашении извести, некоторых явлений электричества, расширения воды при замерзании и многими другими. Коротко говоря, Роберт Бойль был истинным сыном своего века — века ломки догм схоластики. Бойль первым отверг пресловутые четыре элемента Аристотеля. При этом Бойль высказал замечательно верную мысль, что настоящие первоначальные элементы будут обнаружены при последовательном разложении вещества на более простые составляющие.
Часть своей кипучей энергии ученый посвятил проблеме биолюминесценции. Имея независимый образ мышления и склонность к анализу, Бойль не стал опираться на скудные сведения древних натуралистов о живом свечении, а проделал сам весь цикл исследований.
Есть сведения о том, что Бойль обратился к изучений органического свечения случайно: его слуга однажды ночью обнаружил, что давно лежавший в комнате кусок телятины ярко светится в темноте. Рассказ об этом заинтересовал знаменитого физика, и он, не откладывая дела в долгий ящик, поставил серию опытов, которые в истории науки о живом свечении считаются классическими.
Что, собственно говоря, вызывало удивление Бойля? Вероятно, то, что свет не был следствием нагревания, что он был «холодным». В то время теория теплового излучения была еще делом далекого будущего, но как естествоиспытатель Бойль знал о зависимости между температурой и яркостью свечения. С другой стороны, ему было известно, что при процессах горения необходим доступ воздуха к горящему веществу. Естественно, что Бойль захотел проверить, будет ли происходить холодное свечение тухлого мяса или другого тела в отсутствие воздуха или нет. Если да — значит между холодным и горячем свечением есть нечто общее. Если нет — следовательно, эти два явления имеют совершенно разную природу.
Поскольку в распоряжении Бойля были вакуумные насосы (с их помощью он установил общеизвестные ныне законы сжатия газов), то план эксперимента напрашивался сам собой.
Бойль поместил кусок светящейся гнилушки под колпак воздушного насоса и стал уменьшать давление под этим колпаком. Вскоре он обнаружил, что люминесценция прекращается в отсутствие воздуха, но возобновляется (хотя и не сразу) после того, как камера снова наполняется воздухом. Эти работы Бойля указывали на прямую связь биолюминесценции с химическими реакциями окисления и изгнали всякий элемент мистики, который мог еще в то время сопутствовать описаниям таинственного свечения ночного леса.
Простые и убедительные опыты Бойля сыграли большую роль в изучении биолюминесценции. Говоря о работах Бойля, мы употребили слово «биолюминесценция». Это не совсем правильно, ведь Бойль не знал, что исследуемое им свечение — биологическое, т. е. обязано живым организмам. Он мог предполагать, что светится фосфор или другое неорганическое вещество, образующееся при гниении.
Но это был только первый маленький шаг по направлению к истинному выяснению механизма явления.
В 1723 г. Реамюр (а в 1797 г. Спалланцани) показал, что при высушивании медузы свечение ее исчезает, но появляется вновь при добавлении воды.
Мы рассказывали выше о «соляной гипотезе», объяснявшей свечение моря. Суть этой гипотезы в неорганическом происхождении люминесценции. Еще в 1761 г. швейцарский химик Бергман направил Королевскому обществу письмо, в котором сообщал, что он наблюдал однажды вечером, когда не было никаких признаков грозы, дождь, искрящийся при падении на землю. Вся поверхность земли при этом становилась похожей на волны света. Это свидетельство заслуживающего доверия ученого опровергало, по существу, соляную гипотезу. Но возможность неорганического происхождения холодного свечения оно оставляло.
Вплоть до 1854 г. не было известно, что свечение леса производится исключительно живыми организмами. Между работами Бойля, доказавшими, что холодное свечение гнилушек связано с химическими реакциями, и установлением того факта, что эти реакции могут протекать лишь в живой клетке, прошло почти 200 лет. Современным исследователям, привыкшим к быстрым темпам развития науки, это непонятно. Ведь биолюминесценция — такое явление, которое наблюдается повсеместно. При желании, всякий ученый мог бы собрать огромное число показаний очевидцев. Таким образом, даже не выходя из кабинета, можно было с помощью сопоставления фактов обнаружить органическое происхождение явления.
Однако не следует обвинять натуралистов прошлого в неспособности сделать правильные выводы из накопившегося материала. Дело в том, что рассказы очевидцев — плохая основа для научных обобщений. Не всегда выдающееся явление люминесценции видят такие люди, как Бергман. Чаще всего сильное свечение моря или сырого леса случайно предстает взору людей, чрезвычайно далеких от науки. Их свидетельства бывают запутанными, возбуждение заставляет их преувеличивать. Вспомним хотя бы, сколько было в зарубежной прессе показаний «очевидцев» о летающих блюдцах!
В 1753 г. Беккер установил, что свечение моря возникает главным образом благодаря микроорганизмам, которые получили название «Noctiluca». Это было крупнейшее достижение после работ Бойля. Вслед за открытием Беккера в литературе появились описания новых светящихся бактерий.
В 1810 г., выступая перед Королевским обществом, Мак-Картни подвел итоги исследований холодного свечения, наблюдаемого в природе: «Многие авторы приписывают свечение моря не светящимся животным, а другим причинам. Мартин предполагает, что это — результат гниения; Зильбершлаг считает, что причина — фосфор. Профессор Майер считает, что поверхность моря поглощает свет, который затем освобождается. Вайон и Джентли думают, что свет моря обязан электричеству, ибо он возбуждается трением».
Мак-Картни считал вполне возможным исключительно животное происхождение люминесценции моря. Так в то время думали многие. По запаху гнилушки догадывались об участии в ее свечении каких-то грибков. Круг постепенно сужался — настойчивые поиски вынуждали ученых отбрасывать ложные теории о причинах природного холодного свечения.
В 1830 г. Микаэлис заподозрил, что в свечении гнилой рыбы повинны микробы, паразитирующие на разлагающейся ткани. В 1854 г. Геллер окончательно доказал, что свечение тухлых продуктов вызывается живыми бактериями, а свечение гнилушек — живыми грибницами. Он выделил светящуюся грибницу, которую назвал Rhizomorphu Noctiluca. Так завершился первый большой цикл исследований, открывший широкую дорогу более углубленному изучению люминесценции. Стало ясно, что это явление связано в природе с процессами жизнедеятельности.
Успехи микроскопии и разработка лабораторной методики биологических исследований способствовали изучению биолюминесценции. В 1875 г. Пфлюгер перенес светящихся бактерий, паразитирующих на тухлой рыбе, на питательную среду. Организмы продолжали светиться, они жили и размножались в искусственно созданных условиях. При этом было очень удобно наблюдать за ними и выявлять их свойства.
Новая лабораторная техника позволила сделать следующий важнейший шаг вперед. Опыты французского ученого Рафаэля Дюбуа, поставленные в 1884 г. в Лионском университете, дали неожиданный результат: оказалось, что свечение живых организмов возникает при наличии двух различных по своим свойствам субстратов, находящихся в теле животного.
Ученый разделил жидкость, содержащуюся в светляках, на две различные химические составные части. По отдельности они не светились, а при смешении давали люминесценцию. Дюбуа подверг вещества дальнейшему исследованию. Он прокипятил препарат № 1 и смешал с непрокипяченным препаратом № 2. Свечение возникло. Тогда был подвергнут кипячению препарат № 2. В этом случае свечение не появлялось, независимо от того, был ли подвергнут термообработке первый препарат или нет. Из этих экспериментов можно было заключить, что биолюминесценция возникает при окислении термостойкого препарата, которое происходит лишь в присутствии фермента, т. е. катализатора, не выносящего нагревания. Почему следовало сделать такой вывод?
Со времен Бойля стало известно, что энергия биолюминесценции возникает за счет окисления (свечение прекращается в отсутствии кислорода). Естественно было предположить, что один из двух препаратов и есть окисляемый субстрат. Однако, поскольку препараты отдельно не светились, можно было понять, что реакция окисления сама по себе идет очень слабо и для усиления интенсивности необходим катализатор. Иначе говоря, один из препаратов является окисляющимся поставщиком энергии свечения, а другой — веществом, ускоряющим реакцию.
Примеров катализных реакций в химии много, особенно они распространены в органических соединениях. Но какой из препаратов дает свечение, а какой его стимулирует?
Чтобы ответить на этот вопрос, нужно было взглянуть на результаты изучения катализных реакций органической химии. Во всех случаях ферменты обладают значительно большим молекулярным весом, чем поставщики энергии, значительно более сложной структурой и включают в себя белковые молекулы. Поэтому они теряют свои свойства ускорять реакцию, денатурируются при нагревании и других видах воздействия. Короче говоря, фермент — очень «нежное» и «чувствительное» соединение. Нетрудно заключить, что термостойкий препарат окисляется, а нетермостойкий является ферментом.
В 1887 г. Дюбуа повторил свои опыты и результаты вновь подтвердились. Фракцию, которая окисляется кислородом воздуха, Дюбуа назвал люциферином, а фермент, стимулирующий люминесцентную реакцию окисления люциферина, — люциферазой.
Дальнейшие работы в области биолюминесценции развивались под влиянием достижений Бойля и Дюбуа. Были открыты различные приемы разделения и очистки люциферина и люциферазы, проводились кропотливые исследования свойств этих веществ, выделенных из различных светящихся животных. Выяснялось отношение препаратов к кислороду и другим химическим веществам. Ставились интересные опыты по воздействию люциферазы одних организмов на люциферин других.
Ученые нашли, что люцифераза теряет свои активные свойства не только при кипячении, но даже при нагревании до 60°. Это означало, что фермент обладает сложным строением. Подобно другим ферментам, люцифераза теряет свою активность при попадании на нее ультрафиолетовых лучей. Постепенно выяснялось, что люцифераза инактивируется при всех воздействиях, вызывающих денатурацию белка. Это значило, что люцифераза — белковое вещество. Было установлено, что в присутствии люциферазы окисление люциферина идет в сто раз быстрее, чем без фермента.
Крупнейший исследователь биолюминесценции Эдмунд Ньютон Гарвей с учениками открыл множество люциферин-люциферазных реакций. Он выделил ответственные за свечение препараты из американских светляков (Photinus и Photurus), японских светляков (Lucioda), японских рачков (Cypridina и Pyrocypris), морских многощетинковых червей (Odontosyllis) и глубоководных креветок (Systellaspis).
В последнее время люминесценция люциферина под воздействием люциферазы была воспроизведена в лабораторных условиях на препаратах, извлеченных из пресноводных организмов (Limped Latia), светящихся бактерий (Ahromobacter и Photobacterium), простейших (Gonyaulax), рыб, люминесцирующих грибов, морских анютиных глазок, глубоководной креветки.
Таким образом, прорыв, сделанный Рафаэлем Дюбуа, привел к широкому наступлению на фронте науки. Однако, несмотря на совершенную лабораторную методику, разделить люциферин и люциферазу удалось не для всех известных светящихся видов. Например, не воспроизведена люциферин-люциферазная реакция для радиолярий, медуз, ктенофор, земляных червей и т. д.
Можно ли быть уверенными, что люциферин и люцифераза имеются во всех светящихся животных и что рано или поздно эти вещества обязательно будут найдены и в тех организмах, в которых их сейчас обнаружить не удается? Результаты исследований говорят: нельзя. Для некоторых организмов прямо показано, что их биолюминесценция обусловлена только одним веществом. В первую очередь это относится к медузам. Детальные исследования позволили установить, что медуза светится за счет специфического белка экварина, люминесцирующего без ферментов.
Явление биолюминесценции оказалось белее сложным, чем можно было предполагать после первых результатов Дюбуа. Ученые не смогли разделить экварин на фракции, хотя применяли для этого различные химические и физические методы. Особенность экварина заключается также в том, что его свечение возникает при контакте с двухзарядными положительными ионами кальция в отсутствии кислорода. Иными словами, для свечения медузы (Aeguorea) нужны только два компонента: экварин и кальций. В тех случаях, о которых мы говорили выше, нужны, по крайней мере, три компонента: люциферин, люцифераза и кислород.
Медуза — не единственное животное, свечение которого не требует кислорода. Кроме нее этим свойством обладают радиолярии и ктенофоры.
С другой стороны, есть такие светящиеся животные, которые используют многокомпонентную реакцию. Нельзя сказать, что люминесценцию этих организмов определяют только окислитель, окисляемое вещество и фермент. Многочисленные работы 50—60-х годов нашего столетия выявили удивительное многообразие реакций, приводящих к свечению животных. Накопился материал, позволяющий условно разбить эти реакции на семь основных типов: 1) взаимодействие специфического белка (экварина) с кальцием в отсутствие кислорода; 2) взаимодействие перекиси водорода с энергетическим субстратом (LH2), ускоряемое катализатором белковой природы (Е) (реакция идет без кислорода); 3) простейшая люциферин-люциферазная реакция Дюбуа, в которой принимают участие три компонента — энергетический субстрат люциферин (LH2), специфический фермент катализатор — люцифераза (Е) и кислород; 4) реакции, требующие помимо люциферина, люциферазы и кислорода еще и восстановленного дифосфорпиридиннуклеотида (ДПН—Н); 5) реакции, идущие только в присутствии одного из аденозинфосфатов (АТФ, АМФ); 6) реакции, требующие присутствия флавина (ФМН—Н2) или альдегида; 7) самоокисление жиров.
Сейчас изучение биолюминесценции тесно переплелось с изучением биохимических реакций. Наука о живом свечении стала отраслью более общей науки, называемой физиологией клетки. Подробное рассмотрение молекулярного механизма биолюминесценции помогает ученым приблизиться к разрешению величайшей научной проблемы современности: что такое жизнь и как она возникла на Земле?
Формы животных очень разнообразны. Но всем им присущи общие черты: организмы строятся из клеток, клетки из белка и нуклеиновых кислот. Способы биолюминесценции различны. Но ни одна из реакций, приводящих к свечению тканей, не выпадает из класса реакций, характерных для жизнедеятельности вообще.
Но тогда встает вопрос: почему же биолюминесценция встречается так редко?
А редко ли? Может быть, мы просто не замечаем ее?