Ван ден Берг и Роуз изучали действие замораживания на pH и на состав растворов различных фосфатов натрия и калия, обычно используемых в качестве буферов в физиологических срезах.
Точка замерзания 0,02 М раствора NaH2PO4 была —0,1°. Во время охлаждения от —0,1 до —9,7° наблюдалось выпадение только кристаллов льда, а концентрация раствора повысилась до 3,42 М. В то же время величина pH понижалась от 4,05 до 3,3. При охлаждении 0,02 М раствора Na2HPO4 замерзание начиналось при температуре —0,1° и выпадение одних кристаллов льда продолжалось до температуры —0,5°, при которой величина pH понизилась от 9,3 до 8,9, а концентрация раствора повысилась до 0,11 М. Когда охлаждали растворы, содержащие обе соли, общая концентрация повышалась до тех пор, пока температура не достигала эвтектической точки при 990. Во всех растворах, в которых молярное соотношение NaH2PO4 и Na2HPO4 было меньше 3,42:0,06, величина pH понижалась, когда выпадали кристаллы льда и Na2HPO4, в пределах температуры от —0,1 до —9,9°. В растворах, в которых соотношение K2HPO4 и Na2HPO4 было больше 3,42 :0,06, величина pH повышалась во время охлаждения при выпадении кристаллов льда и Na2HPO4.
Эвтектическая точка растворов, содержащих КН2РO4 и K2HPO4лежала при —16,7°, а конечная величина pH равнялась 7,5. В растворах, содержавших первоначально обе соли в различном соотношении, pH варьировал между 4,0 и 9,0. Во всех растворах, в которых молярное соотношение КН2РO4 и K2HPO4 было меньше 1,30:2,70, величина pH понижалась при выпадении кристаллов K2HPO4 и льда. В тех случаях, когда исходное соотношение солеи в растворах было больше, величина pH повышалась, когда выпадали кристаллы KH2PO4 и льда.
Ван ден Берг и Роуз изучали также изменение pH и состава растворов, содержащих 2, 3 и 4 различных фосфата натрия и калия. Они составили таблицы и специальный график, с помощью которых можно было определить влияние выпадения кристаллов солей и льда на pH любого раствора, содержащего фосфаты натрия и калия. Эти авторы обнаружили, что в данном растворе при определенной температуре пересыщение может вызвать временные, но значительные отклонения pH от нормы. Такие метастабильные состояния не влияли на окончательную величину pH и на соотношение солей при конечном стабильном состоянии. Однако они могли служить источником некоторых нарушении и затруднений во время замораживания забуференных растворов, в которых были взвешены живые клетки. Авторы пришли к выводу, что в тех случаях, когда во время замораживания не желательно увеличение кислотности, в буфере должны преобладать K2HPO4 и KH2PO4. Устойчивую величину pH можно поддерживать, используя раствор, в котором исходной концентрацией солей является концентрация, наблюдавшаяся в эвтектической точке. Это так называемый эвтектический раствор, или эвтектическая смесь. Так, в растворе, содержащем 2,75 М К2НРO4, 0,96 М КН2РO4 и 0,17 М Na2HPO4, исходная величина pH была 7,5. Точка замерзания данного эвтектического раствора лежит при —17,2°, и его pH при охлаждении до этой температуры не изменяется.
Величина pH различных растворов с фосфатным буфером значительно изменяется при замораживании, если эти растворы содержат также хлористый натрий и хлористый калий. В присутствии хлористого натрия pH обычно понижается больше, а pH эвтектического раствора подвергается значительным изменениям. Добавление хлористого калия относительно мало влияет на pH эвтектического раствора, но повышает pH во время начальной фазы замораживания в некоторых буферных растворах. Работы ван ден Берга и Роуза в большой степени способствовали выяснению механизма действия замораживания на pH физиологических сред. Их следовало бы изучить всем, кто интересуется влиянием низких температур на биологические системы. Полученные этими авторами данные показывают, что даже применение различных буферов не устраняет изменения pH, вредно влияющих на клетки во время замораживания.