Так как пшеничная мука содержит протеолитические ферменты и при замешивании теста создаются благоприятные условия для их действия, то имеются все основания предполагать, что клейковинный белок будет подвергаться гидролитическому расщеплению. Однако уже давно установлено (см., например, Козьмина, 1959), что не только в тесте, но даже в жидких мучных болтушках довольно продолжительный автолиз (48 часов) не приводит к заметному накоплению свободных аминокислот.
Слабая активность протеолитических ферментов зерна показана и в опытах с действием очищенных препаратов этих ферментов на чистые препараты глиадина и глютенина пшеницы в оптимальных условиях (Blagoveschenski, Jurgenson, 1937; Юргенсон, 1936; Благовещенский, 1940). Однако отсутствие заметного расщепления по пептидным связям еще не говорит о полной инертности клейковинных белков по отношению к протеолитическим ферментам. Хорошо известно, что тесто, приготовленное из муки и воды (без дрожжей), при стоянии непрерывно ослабевает, размягчается, становится более растяжимым и менее упругим. Это ослабление теста в процессе, его автолиза неоднократно изучалось с помощью различных приборов, например фаринографа, экстенсографа и др. (Ауэрман, 1938), или по расплываемости шарика теста с течением времени. Ослабление теста происходит вследствие изменения физических свойств клейковины под влиянием протеолитических ферментов. Многочисленными данными (см. Козьмина, 1959) установлено, что при автолизе мучных болтушек и теста наблюдаются лишь начальные стадии протеолитического расщепления клейковинного белка. Пептидные связи в белке почти не расщепляются, аминный азот не накапливается, но разрыв каких-то иных ближе не изученных связей ведет к заметному, а в ряде случаев очень сильному, дезагрегированию клейковины, ее ослаблению, размягчению и даже разжижению. Химически за процессом дезагрегирования клейковины можно проследить по накоплению в автолизатах первоначальных продуктов протеолиза, например водорастворимых азотистых веществ, не осаждаемых 2%-ной трихлоруксусной кислотой. Своеобразный характер протеолитического расщепления клейковинного белка, сопровождаемый полным разжижением клейковины без накопления свободных аминокислот, был впервые обнаружен А. В. Благовещенским и Н. И. Соседовым (1934) при изучении пшеницы, поврежденной клопом-черепашкой. Позднее Н. И. Проскуряков и А. А. Бундель (1938) и Л. Я. Аэурман (1938) подробно исследовали химическими и физическими методами протеолитические процессы, происходящие в тесте как непосредственно, так и при добавлении к нему протеолитических ферментов (папаина), активаторов и ингибиторов протеолиза в зависимости от исходного качества клейковины и ряда других условий и факторов, Результаты этих опытов, подтвержденные впоследствии с разных сторон и другими исследователями (Harris, 1938, 1939; Harris, Johnson, 1939, 1940), прочно установили общую картину первоначальных стадий протеолиза клейковинного белка: его дезагрегирование, изменение физических свойств в направлении ослабления и разжижения, увеличение растворимости, накопление растворимых продуктов распада, не осаждаемых трихлоруксусной кислотой, и почти полное отсутствие гидролиза пептидных связей.
В бродящем тесте ход протеолиза клейковинного белка осложняется наличием дополнительных факторов, например глютатиона дрожжей, различных ингредиентов, добавляемых к тесту, улучшителей типа броматов, ферментных препаратов и т. д. Особенное значение для изменения свойств клейковины имеет накопление в тесте органических кислот, присутствие которых приводит к значительному увеличению водорастворимого азота за счет набухания и пептизации клейковинного белка.
Интересные данные о характере изменения клейковины в тесте при приготовлении хлеба в производственных условиях были опубликованы К. Н. Чижовой (1957). Полученные ею результаты показывают, что в процессе тестоведения происходит уменьшение количества сухой клейковины вследствие перехода клейковинного белка в раствор без заметного распада его до продуктов, не осаждаемых трихлоруксусной кислотой. В то же время оставшаяся клейковина, отмываемая из теста обычным способом, обнаруживает значительное уплотнение, гидратация ее снижается, например с 207 до 177%, а время истечения из пластометра возрастает от 45 до 331 сек. Специальными опытами, изменяя рН теста и содержание в нем протеолитических ферментов (папаина), К. И. Чижова показала, что уменьшение выхода клейковины и укрепление ее зависят от наличия кислот, тогда как. протеолитические ферменты в небольших концентрациях способствуют ослаблению клейковины и увеличению ее выхода при отмывании благодаря повышению гидратации. В производственных условиях все указанные факторы действуют совместно, и от их соотношения в каждом отдельном случае зависит характер изменений клейковины при тестоведении.
В заключение следует отметить, что вопросы механизма дезагрегации клейковины протеолитическими ферментами, сущность происходящих при этом процессов, характер связей, расщепляемых протеазами до гидролиза пептидных связей, и природа продуктов первичного распада клейковинного белка остаются до настоящего времени еще совершенно неисследованными.
Действие протеолитических ферментов на клейковину при прорастании зерна
Процесс распада клейковины при прорастании семян пшеницы изучен очень мало. Олсон (Olson, 1917) отметил резкое уменьшение содержания сухой клейковины (от 10—14% до 0,3—2,0%) в прорастающем зерне при одновременном снижении количества глиадина и глютенина и увеличении растворимого азота, в том числе амидного (с 0,08 до 9,09%). Специальное исследование изменений клейковины при прорастании зерна, проведенное Н. П. Козьминой и М.. С. Романовой (1938), показало, что количество сырой и сухой клейковины заметно снижается после трех суток прорастания пшеницы, причем качество клейковины резко ухудшается. Уже после двух суток проращивания клейковина сильно крошится и с трудом слипается в общую массу. После четырех суток проращивания клейковину отмыть не удается, однако обезжиривание муки позволяет отмыть ее нормально. Этот опыт показывает, что укрепление клейковины при прорастании происходит в результате действия на нее продуктов распада жира — ненасыщенных свободных жирных кислот, а не протеолитических ферментов. Действительно, определение кислотного числа жира в проросшем зерне говорит о значительном гидролизе его в процессе прорастания. Если же зерно проращивать в течение более продолжительного периода времени, например в течение 7 и 10 суток, то обезжиривание не дает положительного результата и клейковина не отмывается, по-видимому, .вследствие далеко зашедшего протеолиза белка. Содержание глиадинового азота падает при этом от 45,2% от общего азота в исходном зерне до 36,9% через трое суток, 22,0% через 7 суток и 15,5% через 10 суток проращивания.
Характер изменения качества клейковины при прорастании зерна зависит, по-видимому, от соотношения протеолитической и липолитичеекой активности пшеницы. В описанных опытах гидролиз жира доминировал над распадом белка и клейковина укреплялась. В работе Н. П. Козьминой и В. Н. Ильиной (1956) отмечен противоположный случай: после двух суток проращивания клейковина разжижалась.
Удельная растяжимость ее увеличивалась с 0,8 до 8,0 см/мин, при одновременном уменьшении выхода сухой клейковины с 10,6 до 4,5%.
Аналогичные результаты ослабления клейковины и увеличения ее растяжимости (с 25 до 70 см по линейке) в результате проращивания пшеницы получил И. Я. Самолевский (1954).
Следует отметить, что подробное изучение изменений клейковины при прорастании зерна представляет весьма большой интерес. В процессе прорастания происходит довольно посте-пенный ферментативный распад сложного комплекса клейковины, начиная от изменений ее физического и физико-химического состояния и кончая полным расщеплением клейковинного белка до отдельных аминокислот. Одновременно с этим в клетках проростка появляются активные ферменты, новообразование которых, вероятно, тесно связано с превращениями запасного клейковинного белка.
Систематическое изучение последовательных стадий расщепления клейковины в процессе прорастания семени поможет выяснению, как механизма действия протеолитических ферментов, так и строения клейковинного белка.