Водные растворы салицилата и бензоата натрия обладают способностью полностью диспергировать клейковину пшеницы, причем образуются гомогенные более или менее опалесцируюшие белковые золи, легко очищаемые от небелковых примесей, содержащихся в клейковине (и прежде всего от остатков крахмала), с помощью центрифугирования или фильтрования (Cook, Rose, 1934; Княгиничев и Горелкина, 1937).
Несмотря на то что как салицилат, так и бензоат относятся к веществам, денатурирующим белки, действие их на клейковину значительно слабее, чем денатурация, вызываемая щелочью, кислотой или мочевиной. Вследствие этого растворы салицилата и бензоата натрия довольно часто применяются при исследовании различных свойств клейковины в диспергированном состоянии и в настоящее время их следует считать лучшими из известных растворителей, диспергирующих клейковину целиком. Наиболее изучены свойства клейковинных дисперсий в водных растворах салицилата натрия, тогда как растворы бензоата применялись гораздо реже. Дисперсию клейковины можно получить, либо помещая в раствор салицилата или бензоата маленькие кусочки сырой клейковины (5—10 г сырой клейковины на 100 мл растворителя), либо экстрагируя непосредственно муку указанными растворами. В обоих случаях смесь хорошо перемешивают, оставляют на некоторое время (от 6 до 24 часов) для набухания и растворения клейковины, а затем центрифугируют и фильтруют. По содержанию азота в фильтрате определяют количество белка, перешедшего в раствор. Растворимость клейковины в салицилате и бензоате зависит от концентрации растворителя марки и чистоты используемых реактивов, реакции среды, температуры, соотношения белка и растворителя, длительности извлечения, а также от качества клейковины в исследуемой муке. В зависимости от концентрации растворителя и реакции среды в растворы салицилата и бензоата натрия переходят следующие количества азота, выраженные в процентах от общего азота исходной клейковины или муки. Расхождения между данными отдельных авторов зависят, по-видимому, от различий в исходном материале, чистоте реактивов и методике приготовления дисперсий.
Интересно, что повторное экстрагирование сырой клейковины растворами салицилата натрия низкой концентрации увеличивает количество растворенного азота лишь до известного предела. Например, 9-кратное экстрагирование клейковины 2%-ным салицилатом натрия извлекает около 52% всего азота клейковины, причем заметное растворение происходит только при первых трех экстракциях. Если же клейковину диспергировать нацело в более концентрированном растворе са-лицилата, например в 10%-ном, а затем разбавить дисперсию водой до 2%, то часть клейковины выпадает в осадок и в растворе остается около 51% от общего азота клейковины, т. е. именно та фракция, которую можно диспергировать 2%-ным салицилатом натрия.
Из дисперсий в растворах салицилата и бензоата натрия клейковина может быть вновь выделена путем высаливания сернокислым магнием (около 0,2 от насыщения) или с помощью разбавления большим объемом воды (приблизительно 20-кратным), а также диализом. Во всех этих случаях из гомогенной дисперсии постепенно осаждается масса, которая при осторожном промывании водой и разминании превращается в типичною сырую клейковину.
Эти наблюдения показывают, что салицилат и бензоат не денатурируют клейковинный белок в такой степени, чтобы он лишился характерных для него физических свойств: связности, упругости, растяжимости и т. п. Все же некоторая денатурация, несомненно, происходит, так как свойства выделенной из дисперсии сырой клейковины часто отличаются от свойств исходной клейковины в том отношении, что первая является несколько более жесткой, упругой, имеет меньшую связность и растяжимость. Растворители как бы укрепляют клейковину. Эти изменения в некоторых случаях бывают незначительными, а в других наблюдается резкая порча клейковины. Опыты автора настоящей работы (не опубликована) показали, что большое значение при этом имеет реакция дисперсионной среды, а также время диализа или отстаивания разбавленной дисперсии. Если разбавлять или диализовать дисперсию сырой клейковины, то выпавший осадок полнее сохраняет качества исходной клейковины, чем при выделении его теми же методами из дисперсий муки. Все же в ряде случаев удавалось осаждать клейковину хорошего качества и из дисперсий муки как в салициловом, так и в бензойном растворе. Исходное качество клейковины, ее устойчивость к денатурации также, вероятно, имеет значение при регенерировании ее из дисперсий. Во всяком случае, существуют условия, при которых денатурация клейковины салицилатом или бензоатом является минимальной.
Доказательством меньшей денатурации клейковины в салицилатной дисперсии по сравнению с дисперсиями ее в растворах щелочи, кислоты и мочевины служат результаты обстоятельной работы канадских исследователей по измерению вязкости указанных дисперсий (Rose, Cook, 1935). При одинаковом содержании азота в дисперсиях относительная вязкость н удельный гидродинамический объем, т. е. объем, занимаемый 1 мг белкового азота и характеризующий
Эффективные размеры гидратированиых частиц дисперсной фазы, заметно выше для клейковины, диспергированной в растворе салицилата по сравнению с дисперсиями ее в кислоте и особенно в щелочи.
При хранении (t°— 25°) вязкость дисперсий клейковины в 8—10%-ном растворе салицилата натрия, содержащем 5 мг азота на каждый грамм дисперсии, не изменяется в течение многих дней, тогда как вязкость дисперсий той же концентрации в уксусной кислоте и едкой щелочи
Непрерывно снижается. Кук и Роуз (Cook, Rose, 1935) проследили за гидролитическим
Расщеплением клейковины в различных дисперсиях, хранившихся в течение 6 часов —36 дней при 0 и 25°, а также подвергавшихся в некоторых опытах тепловой обработке. При всех исследованных условиях количество небелкового азота составляло в процентах от общего азота/
Таким образом, очевидно, что салицилат действует на клейковину много слабее, чем другие растворители.
Н. И. Соседов, А. Б. Вакар и 3. Б. Дроздова (1940) показали, что вязкость салициловой дисперсии сырой клейковины плавно снижается при добавлении к ней раствора папаина или вытяжки из зерна, содержащей протеолитические ферменты. Если действовать вытяжками из разного зерна на одну и ту же дисперсию клейковины в салицилате, взятую в качестве стандартного субстрата, то по степени снижения вязкости за определенное время можно судить о протеолитической активности изучаемого зерна. С другой стороны, измеряя падение вязкости дисперсий, приготовленных стандартным способом из клейковины разного зерна, под влиянием одинаковых добавок папаина получают данные о резистентности или «атакуемости» белков изучаемого материала. Преимущество этого метода перед другими заключается в том, что он дает возможность проследить за протеолитической активностью зерна в самых первых ее проявлениях, когда еще нет заметного накопления продуктов распада белка, а изменяется лишь его агрегатное состояние (дезагрегация).
Вязкость салициловых дисперсий клейковины может снижаться не только при действии протеолитических ферментов, но также при добавлении восстановителей. Юди (Udy, 1953) наблюдал немедленное уменьшение вязкости дисперсий сырой клейковины в 8%-ном растворе салицилата натрия после добавления бисульфита натрия или тиогликолевой кислоты (0,0025—0,01 М). Автор предполагает, что причиной снижения вязкости является восстановление дисульфидных связей клейковинного белка, ведущее к разрыву дисульфидных «мостиков», а следовательно, к уменьшению степени агрегации белковых молекул. Вычисления показали, что внутренняя вязкость клейковины в дисперсии снизилась под влиянием восстановителей от 0,309 до 0,248, независимо от величины рН, концентрации и природы восстановителя (указанные факторы влияли только на скорость достижения конечной вязкости, но не на ее величину), что указывает, по мнению Юди, на полный разрыв всех дисульфидных связей в клейковине.
Большой интерес представляют исследования молекулярного веса, агрегатного состояния и электрических свойств частиц целой клейковины и ее фракций в салициловой дисперсии.
С помощью ультрацентрифугирования и диффузионных измерений Мак-Колла и Грален (McCalla, Gralen, 1940, 1942) показали, что при диспергировании сырой клейковины в растворах салицилата натрия только определенный процент белка образует истинный (молекулярный) раствор. Каждая концентрация салицилата натрия способна перевести в молекулярный раствор лишь определенную часть всей диспергированной клейковины.
Таким образом, наилучшим растворяющим действием обладает 12%-ный раствор салицилата натрия, в котором 84% всей диспергированной клейковины находится в молекулярном растворе.
Для решения вопроса о гомогенности или гетерогенности клейковинного белка Мак-Колла и Грален разделили исходную сырую клейковину на четыре фракции, осаждая их из салициловой дисперсии возрастающими количествами сернокислого магния (от 3 до 20% от насыщения). Каждая фракция вновь растворялась в 12%-ном салицилате и с помощью ультрацентрифуги определялся ее молекулярный вес. Было показано, что не только исходная клейковина, но и каждая фракция ее крайне негомогенны. Ни одна из них не была полностью молекулярно диспергирована, хотя количество белка в молекулярном растворе увеличивалось с увеличением растворимости фракций. Во всех фракциях отмечено наличие агрегатов разных размеров. Молекулярный вес наиболее растворимой фракции оказался равным 44000, а наименее растворимой — 1 750 000. Авторы считают, что форма белковых молекул также неодинакова в разных фракциях, но все молекулы построены дисимметрично и являются тонкими и удлиненными.
Несколько позднее Колвин и Мак-Колла (Golvin, McCalla, 1949) исследовали свойства клейковинного белка в салициловой дисперсии методом электрофореза. Оказалось, что клейковина, Диспергированная в 0,5-молярном (8%) растворе салицилата натрия, электростатически гомогенна. Частицы клейковины заряжены отрицательно; изоэлектрическая точка клейковины лежит ниже рН 4,0. Ио мнению авторов, это является следствием избирательной адсорбции ионов салицилата молекулами клейковинного белка. Молекулярно диспергированные частицы клейковины имеют форму эллипсоидов вращения с размерами 25 А в диаметре и 400—450 А в длину.
Так как в растворах салицилата й бензоата натрия клейковина денатурируется относительно мало, то возникла мысль о применении салициловых и бензойных дисперсий для изучения физико-химической природы различий между клейковиной неодинакового качества (крепкой и слабой). В этом направлении сделаны пока еще только первые шаги. В частности, найдено, что растворимость белков муки коррелирует с качеством клейковины в том отношении, что из муки с крепкой клейковиной в раствор бензоата или салицилата переходит меньше азота, чем из муки со слабой клейковиной. Это особенно наглядно видно в тех опытах, где одна и та же мука подвергалась искусственным воздействиям, изменяющим ее клейковину в сторону ослабления или укрепления. Например, в работе Н. И. Соседова, А. Б. Вакара, 3. Б. Дроздовой и др. (1959) нормальную клейковину превращали в слабую, облучая сухое зерно Y-лучами, или в крепкую, воздействуя теми же лучами на сырое зерно. Как видно из табл. 50, ослабление клейковины сопровождалось увеличением, а укрепление — уменьшением растворимости белков муки в 15%-ном растворе бензоата натрия.
Роуз и Кук (Rose, Cook, 1935) сравнили вязкость дисперсий сырой клейковины из «сильной» и «слабой» муки в 12%-ном растворе ‘салицилата натрия (при одинаковом содержании азота в дисперсиях) и получили следующие данные, свидетельствующие, по мнению авторов, о большей степени дисперсности (или меньшей гидратации) клейковины «слабой» муки по сравнению с «сильной».
Прямых данных о качестве клейковины «сильной» и «слабой» муки в работе не приводится.
Геердес и Гаррис (Geerdes, Harris, 1952) показали, что имеются определенные различия в вязкости салициловых дисперсий клейковины из мягкой и твердой пшеницы, которые следует объяснить не только неодинаковой гидратацией частиц клейковины, но и различиями в степени асимметрии белковых молекул исследованных пшениц.
С другой стороны, Юди (Udy, 1953) не нашел никакой разницы в величинах вязкости салициловых дисперсий клейковины из разных пшениц, хотя возможно, что качество клейковины у них было приблизительно одинаковым.
В общем же следует отметить, что вопрос о структурных особенностях белка клейковины разного качества еще совершенно не исследован и при разработке его «мягкие» способы растворения клейковины, обеспечивающие минимум денатурации белка, могут сыграть немаловажную роль.