Попробуем теперь, зная схему строения ДНК» представить себе возможный механизм ее копирования.
ДНК имеет две спирали, и если они разойдутся, то каждая из них сможет построить себе подобную. Это предположение очень хорошо объяснило бы механизм синтеза ДНК. Ученые знали, что во время митотического деления клетки каждая хромосома строит себе подобную, и только после этого ядро удваивается. Не является ли удвоение молекулы ДНК общим принципом для передачи наследственных признаков?
Как только были разработаны методы получения нуклеиновых кислот в чистом виде, за работу принялись физико-химики. Применив весь арсенал методов, которые находятся на вооружении современной науки, они начали изучать свойства ДНК в растворе и попытались хотя «бы частично промоделировать процесс расхождения спиралей нуклеиновой кислоты.
Это оказалось нетрудно, нужно было только подогреть раствор ДНК. Тогда нити ДНК расходились, спираль раскручивалась и молекула ДНК переходила в так называемое денатурированное состояние. Оказалось, что связи между противоположными цепями, которые осуществляются гуанин-цитозиновой парой, прочнее, чем между аденин-тимином, поэтому температура, при которой начинается процесс расхождения спиралей, у ДНК с большим содержанием гуанина и цитозина выше.
Так как все реакции в организме ускоряются специфическими ферментами, то вполне естественно, что биохимики приложил много усилий в поисках ферментных систем, участвующих в синтезе ДНК. После долгих поисков и сложной очистки такой фермент был обнаружен и получил название ДНК-полимеразы. До сих пор упоминалось о дезоксирибонуклеазе, которая расщепляет, гидролизует ДНК. Полимераза, наоборот, синтезирует полимерные молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты.
Первооткрыватель полимеразы Корнберг сделал вытяжки (то есть экстракт) бактерий и попробовал исследовать в них ДНК-синтезирующие системы. Оказалось, что вытяжка из бактерий проявляет ферментативную активность, включая нуклеотиды в ДНК. Другие системы ферментов переводили предварительно нуклеотиды в форму нуклеозидтрифосфатов (соединений, состоящих из основания, дезоксирибозы и трех фосфатных остатков). После включения нуклеозидтрифосфатов в ДНК от них отделялись два остатка фосфорной кислоты. Биохимики всегда стремятся при исследовании механизма ферментативной реакции по возможности изолировать ее от влияния других ферментных систем, которые могут помешать правильному проведению эксперимента. В данном случае Корнберг оставил только вытяжку из бактерий, а нуклеозид-трифосфаты использовал в готовом виде. Он составил смесь из бактериального экстракта и всех четырех нуклеозидтрифосфатов и при этих условиях наблюдал заметный синтез ДНК. Синтез прекращался, если в системе отсутствовал хотя бы один из четырех нуклеотидов. Желая изучить подробнее свойства фермента, ученый продолжал проводить очистку полимеразы от посторонних примесей, но получил неожиданно обратный результат — скорость синтеза заметно уменьшилась.
Оказалось, что в экстракте, с которым работал Корнберг, присутствовало некоторое количество ДНК-клетки бактерий кишечной палочки разрушались, а ДНК оставалась. Попробовали внести в очищенные препараты малую порцию ДНК — и сразу начался синтез, причем сумма конечных продуктов превосходила количество начальных более чем в 10 раз. Из этого опыта вытекало, что для синтеза ДНК необходимо некоторое количество ДНК — для «затравки» — и только тогда может идти реакция образования новой ДНК. А что произойдет, если вместо ДНК бактерий кишечной палочки внести ДНК какого-либо другого организма, например из зобной железы теленка? Синтез ДНК с участием бактериальной полимеразы шел все равно. ДНК образовывалась и тогда, когда в качестве «затравки» вносили ДНК и бактериофага и из других источников.
Эти данные говорят о том, что полимераза не обладает видовой специфичностью, то есть ее действие универсально. В таком случае возникает вопрос: каким образом сохраняется биологическая специфичность на одном из самых главных участков передачи генетической информации — во время синтеза ДНК? Ответ дали дальнейшие опыты.
Изучение нуклеотидного состава ДНК, полученной в пробирке, вне живого организма, дало поразительные результаты. Химический состав вновь синтезированных нуклеиновых кислот полностью соответствовал ДНК-«затравке». Следовательно, при одном и том же ферменте, катализирующем синтез ДНК» получаются нуклеиновые кислоты различного состава. Специфичность в данном случае зависит только от ДНК-«затравки».
Синтез новых молекул ДНК (происходит так. ДНК-полимераза, подобно рабочему-сборщику, выстраивает вдоль цепи ДНК нуклеозидтрифосфаты, отнимает два фосфатных остатка и связывает нуклеотиды в единую полимерную нить. Сборка ведется на шаблоне, где против аденина-«затравки» располагается тимин нуклеозидтрифосфат, добавленный к среде, и так далее, по правилу Чаргаффа. В связи с этим становится понятно, почему для синтеза новой ДНК в системе Корнберга необходимо присутствие всех четырех нуклеозидтрифосфатов, так как в противном случае единой цепи не получится из-за пустых, незаполненных мест.
В этих опытах пригодились результаты экспериментов с нагреванием ДНК. Когда в систему добавляли в качестве ДНК-«затравки» молекулы с предварительно денатурированной вторичной структурой, то синтез новых молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты шел наиболее интенсивно. Это и понятно, так как для деятельности ДНК-полимеразы необходима свободная спираль ДНК. Дальнейшими работами Корнберг установил, что во фракции, в которую входит полимераза, по всей видимости, есть и другой фермент, специально предназначенный для раскручивания молекул двуспиральной ДНК.
В 1957 году был проделан эксперимент, подтвердивший предположение о возможности удвоения ДНК внутри клетки. Представьте себе растущих бактерий. Предположим, их число равно А. Ученые провели такой опыт. Вначале бактерии выращивали на среде, где кроме других источников питания была соль аммония; в ней обычный азот был замещен стабильным изотопом азота, обладающим большим атомным весом. Удельный вес такого изотопа больше обычного.
В таком случае все содержащие азот органические вещества, в том числе и ДНК, должны быть тяжелее по удельному весу, так как их «утяжелял» изотоп азота.
Затем эти бактерии переносили в питательную среду, где «тяжелого» азота уже не было, а вместо него был обычный, легкий азот. На этой среде количество бактерий увеличивалось вдвое, до числа 2А.
Сейчас биологи располагают очень мощной экспериментальной техникой, которая позволяет им с точностью до третьего знака определить удельный вес молекул ДНК. Авторы этого опыта, американские ученые Сталь и Мезельсон, рассуждали так: если ДНК расходится на образующие ее спирали в процессе роста и развития клеток (в данном случае бактерий), то ДНК из бактерий на стадии числа А будет тяжелее, чем на стадии 2А, где для построения второй спирали каждая из разошедшихся половинок должна уже использовать источники с «легким азотом». Вес ожидаемой «гибридной» ДНК было легко рассчитать.
Для решения этой задачи ученые применили ультрацентрифугу. Результат «взвешивания» показал, что при одном цикле удвоения числа бактерий на стадии 2А в выделенных препаратах большинство молекул ДНК имеет удельный вес, средний между весом тяжелой и легкой ДНК. Последующий цикл еще больше уменьшал удельный вес получаемых препаратов. Этот изящный опыт прямо указал на существование механизма удвоения ДНК во время процесса размножения.
Мы уже говорили, как важен порядок расположения аминокислот для проявления специфических функций белков. Понятно, чтобы получить прямое доказательство кодирования аминокислот. в белке специфическим расположением нуклеотидов в ДНК, было бы весьма заманчиво. проследить на всех стадиях синтез белка с известной последовательностью аминокислот при помощи нуклеиновой кислоты, где тоже была бы известная последовательность нуклеотидов.
К решению этого вопроса ученые шли разными путями. Прямо разрешить эту задачу оказалось невозможно. Если определение аминокислотной последовательности сейчас проводится успешно, то получить представление о последовательности нуклеотидов в ДНК имеющимися методами пока нет возможности. Трудность связана с тем, что слишком мало типов нуклеотидов в ДНК — всего 4. Поэтому при их частичном отщеплении очень легко получить неверные данные о порядке их расположения, так как многие из однотипных нуклеотидов в молекулах ДНК следуют подряд один за другим. Преодолевая очень большие технические трудности и применяя нуклеазы, действующие на различные связи в нуклеиновой кислоте, ученым пока удалось установить природу только нескольких концевых нуклеотидов молекулы РНК вируса табачной мозаики.
К решению проблемы кодировки аминокислот нуклеиновой кислотой удалось подойти косвенно. Нельзя ли, например, изменить последовательность нуклеотидов в нуклеиновой кислоте и потом попытаться изучить изменения в белке, синтез которого она направляет? Если бы такие изменения происходили, то задачу кодирования нуклеотидов специфического расположения аминокислот можно было бы считать частично решенной. Оказалось, что такой путь наиболее правилен.
Однако для строгого доказательства необходимо иметь молекулу нуклеиновой кислоты и молекулу белка, синтез которого направляется именно этой молекулой нуклеиновой кислоты. Идеальный объект в этом отношении — вирус табачной мозаики. В нем всего одна молекула нуклеиновой кислоты (РНК) и белок одного типа.
Из вируса табачной мозаики выделили РНК и подействовали на нее азотистой кислотой. При этом происходит так называемое дезаминирование, то есть азотистые основания нуклеотидов теряют группу NH2, переходя в другие основания. Иначе говоря, в РНК можно искусственно изменить последовательность нуклеотидов. Оказалось, что изменение последовательности (правда, нельзя было сказать, в каком месте молекулы оно произошло) ведет к появлению частиц вирусов с измененной последовательностью аминокислот в белке. Американский ученый Френкель-Конрат исследовал последовательность аминокислот в мутантных (измененных) штаммах вируса и установил, что порядок чередования изменился, одни аминокислоты оказались вместо других. От этих экспериментов осталось сделать один шаг к решению проблемы генетического кода, то есть к определению того, какие нуклеотиды и как кодируют порядок расположения аминокислот в белках. Этот шаг и сделал американский ученый Ниренберг.