Последние достижения генной инженерии и биотехнологии привели к бурному развитию совершенно нового направления вакцинологии — к ДНК-вакцинам.
Основой ДНК-вакцины является бактериальная плазмида (автономная кольцевая ДНК из 4—6 тыс. пар нуклеотидов), способная эффективно размножаться в клетках Е. coli. В плазмиду генно-инженерными методами (используя ферменты рестриктазы, лигазы и т. д.) встраивают «смысловой» ген, кодирующий иммуногенный белок того вируса, от которого будет защищать ДНК-вакцина. На практике в качестве исходной плазмиды используют модифицированную плазмиду, содержащую эукариотический промотор (обеспечивает высокий уровень экспрессии генов) цитомегаловируса или обезьяньего вируса 40, или вируса саркомы Рауса, и сигналы терминации транскрипции и полиаденилирования, позволяющие продуцировать иммуногенный белок вируса в клетках животных. Кроме того, в плазмиде есть ген устойчивости к антибиотику (например, к ампициллину), необходимому для ее селекции при клонировании и выращивании.
Таким образом получают рекомбинантную плазмиду, которую выращивают (реплицируют) в необходимых количествах в бактериальных клетках Е. coli в присутствии ампициллина и после соответствующей очистки плазмиды используют для иммунизации животных. Обычно используют физиологический раствор, в котором во взвешенном состоянии находятся полученные плазмиды (это снимает проблему реактогенности препарата).
Результаты исследования на лабораторных животных показали, что количество рекомбинантной плазмиды, необходимой для вакцинации при внутримышечном введении, может колебаться в пределах 0,001 — 10 мкг на 1 кг живой массы.
Плазмидная ДНК поглощается клетками животных в небольшом количестве (0,01 — 1,0 %), а большая часть ее быстро разрушается.
Проникшая в клетку ДНК транспортируется в ядро и транскрибируется (клеточной ДНК-зависимой PHK-полимеразой II) с образованием иРНК, которая в цитоплазме на рибосомах клетки обеспечивает синтез полноценного иммуногенного белка возбудителя, что приводит к образованию гуморального и клеточного иммунного ответа и, следовательно, к формированию напряженного иммунитета. Плазмидная ДНК функционирует в клетках до 3—6 мес.
ДНК-вакцины можно вводить внутрикожно, внутримышечно, подкожно, внутривенно, интраназально, орально. Наиболее перспективными считают внутрикожный и внутримышечный методы. Заслуживают внимания результаты по так называемому баллистическому методу введения (gene gun), когда частички золота диаметром 1—2 мкм, покрытые плазмидной ДНК, с помощью специального прибора доставляют в клетки кожи. Для получения одинакового эффекта требуется ДНК в 100—5000 раз меньше, чем при внутримышечном способе введения.
Механизм иммунного ответа при ДНК-вакцинации пока не совсем ясен. Однако имеющиеся данные позволяют предположить, что это выглядит следующим образом. Синтезированный в клетках белок расщепляется в плазматических протеосомах на короткие пептиды (8—16 аминокислот), представляющие собой отдельные эпитопы или антигенные детерминанты. Пептиды транспортируются белками-переносчиками в эндоплазматический ретикулум. Там они связываются с молекулами белков главного комплекса гистосовместимости класса I (ГКГС I) — мембранными гликопротеидами и транспортируются на поверхность клеток, где распознаются цитотоксическими Т-лимфоцитами. Последние активируются, размножаются, и образуется пул цитотоксических Т-лимфоцитов, способных обеспечить гибель клеток-мишеней, т. е. клеток, зараженных вирусом.
Синтезированный в клетках иммуногенный белок может транспортироваться из клетки в межклеточное пространство. Он связывается с антигенпрезентирующими клетками (макрофагами), проникает в них путем эндоцитоза, расщепляется на короткие фрагменты (10—20 аминокислот) белка, которые объединяются с молекулами ГКГС класса II и транспортируются к поверхности клетки, где они узнаются соответствующими клонами Т-хелперов и В-клеток, что приводит к активации В-клеток и дифференцировке их в плазматические клетки, секретирующие антитела. Действие цитотоксических Т-лимфоцитов также стимулируется Т-хелперами посредством продукции ими цитокинов — медиаторов межклеточных взаимодействий.
Таким образом, плазмидная ДНК с встроенным геном иммуногенного белка вируса индуцирует у животных полноценный гуморальный и клеточный иммунный ответ.
Для усиления иммуногенных свойств ДНК-вакцин их вводят совместно с плазмидами, в которые встроены гены цитокинов (регуляторы иммунного ответа). Кроме того, введение ДНК-вакцин в липосомах или в микрокапсулах обеспечивает высокий уровень гуморального и клеточного иммунного ответа.
В настоящее время сконструировано более 20 ДНК-вакцин против различных вирусных болезней животных и человека: бешенства, болезни Ауески, болезни Ньюкасла, инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, лейкоза крупного рогатого скота, ринопневмонии лошадей, синдрома снижения яйценоскости, парвовирусной инфекции собак, СПИДа, герпесвирусных инфекций человека и др.
ДНК-вакцины наиболее перспективны для профилактики болезней, склонных к длительному хроническому течению. Они обладают безопасностью инактивированных и эффективностью живых вакцин. Однако пока нет полных сведений о том, какова эффективность ДНК-вакцин при иммунизации ими людей. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) разработала унифицированные требования к ДНК-вакцинам. Эффективность иммунизации ДНК-вакцинами очевидна, однако технология разработки этих вакцин находится в стадии становления и интенсивного изучения. Потребуется еще немало усилий для практической реализации нового подхода к профилактике вирусных болезней животных и человека.
Примечание. Репликация плазмидной ДНК происходит только в бактериальных клетках, тогда как транскрипция гена иммуногенного белка осуществляется только в клетках млекопитающих. Опыты на животных показали, что плазмидная ДНК не реплицируется, не встраивается в хромосомы и на нее не образуется антител в организме животных.