Основным условием при доказательстве азотфиксирующей способности водорослей является культивирование их на средах без азота; должна быть полная уверенность в том, что увеличение количества азота в культуре явилось следствием использования водорослью именно молекулярного азота.
Второе условие — точное определение количества фиксированного азота. Обычно пользуются классическим методом Кьельдаля с различными модификациями, увеличивающими его точность. Однако считается, что в некоторых случаях, например при наличии связанного азота в среде,
метод Кьельдаля недостаточно надежен ввиду увеличения абсолютной величины отклонений и, кроме того, не дает возможности с одинаковой точностью определять содержание азота во всех типах органических соединений. Гораздо более точным методом доказательства способности к фиксации азота представляется изотопный анализ с использованием N215 в качестве изотопного индикатора. Накопление меченого азота является более чувствительным показателем и позволяет определять фиксацию азота даже на средах, первоначально богатых азотом. Вместе с тем изотопный метод позволяет проследить путь фиксированного азота. Нередко исследователи применяют параллельно оба метода, поскольку изотопный метод не дает абсолютных величин фиксированного культурой азота.
Чтобы исключить возможное участие бактерий в процессе фиксации азота, изучение азотфиксации ведут на культурах, водорослей, полностью освобожденных от сопутствующих бактерий. Для получения бактериологически чистых культур используют различные методы: выращивание культур на кремнекислом геле, обработку антисептиками и антибиотиками, ультрафиолетовое облучение культур ртутно-кварцевой лампой, гамма-облучение и т. д. Оказалось, что особое значение для освобождения синезеленых водорослей от бактерий, населяющих слизь, имеет получение гормогониев или обрывков нитей, свободных от слизи. Поэтому последовательно применяют такие приемы: 1) выращивание культур, полученных из одной нити или из разрушенной при помощи вибратора массы водорослей на безазотистых средах; 2) уничтожение сопутствующих бактерий химическими или физическими агентами; 3) повторные пересевы с проверкой чистоты на бактериальных средах.
Во многих работах испытывались культуры синезеленых, не полностью освобожденные от бактерий. Признание испытуемых видов в качестве азотфиксаторов основывалось на том, что бактерии, выделенные из этих культур, не росли на безазотистых средах и в культурах развивались лишь после накопления органического вещества водорослей. Естественно, что изученные таким путем виды требуют дополнительной проверки. Правда, Бортельс отмечает, что между абсолютно чистыми и альгологически чистыми культурами не обнаруживается разницы в накоплении азота. Проведено сравнение азотфиксирующей способности двух видов водорослей, выделенных с рисовых полей, в абсолютно чистой и в альгологически чистой культурах. В бактериально чистой культуре Scijtonema hofmannii фиксировала 0.73 мг азота на 100 мл среды за 35 дней, а в альгологически чистой («unialgal») 0.9 мг; Fischerella muscicola фиксировала, соответственно, 0.49 и 0.58 мг. Авторы объясняют повышенную азотфиксацию в альгологически чистых культурах фиксацией азота бактериями или стимулирующим действием бактерий на азотфиксирующую деятельность водорослей. С другой стороны, Дарзниек, сравнивая альгологически чистую и бактериологически чистую культуры Calothrix elenkinii, нашел, что первая накапливала меньшую биомассу и фиксировала меньше азота, чем вторая, при этом очистка культуры от бактерий-спутников не привела к снижению жизнеспособности водоросли. Вместе с тем отмечается, что некоторые способы получения бактериологически чистых культур водорослей, например применение антибиотиков, УФ-лучей, соединений хлора, часто являются мутагенными. Поэтому некоторые авторы предпочитают механические способы очистки с отбором колоний, относительно свободных от бактерий, хотя эти методы и не гарантируют очистку от всех бактерий.