При исследовании ряда физиологических и биохимических свойств зародышей позвоночных, в частности амфибий, оказалось, что многие параметры существенно изменяются на стадии средней бластулы.
После 12-го цикла генерационное время резко возрастает. У Xenopus laevis период между двумя последовательными митозами в течение первых 11 циклов составляет немногим более 30 мин, но на 12-м цикле достигает ТО мин и продолжает увеличиваться. Естественно, что в это время происходит уменьшение прироста ДНК в единицу времени в расчете на одного зародыша. Одновременно наблюдается изменение двигательной активности клеток. Если подвижность бластомеров до 11-го цикла выражается лишь в сокращениях кортекса, то в период 12-го цикла бластомеры приобретают способность к образованию псевдоподий и амебоидной подвижности. Синтез РНК, о котором судили по включению радиоактивного уридинтрифосфата, у X. laevis в течение первых 11 циклов очень слаб; 12-й цикл характеризуется резким возрастанием включения этого предшественника РНК, что связано с началом массового синтеза малых ядерных РНК (так называемых «снурп’ов», snurp — small nuclear RNP) и транспортной РНК. Чем объясняется это одновременное изменение таких разнородных параметров, как синтез ДНК, частота клеточных делений, синтез РНК и клеточная подвижность? Поскольку аналогичное совокупное изменение ряда параметров происходит не только в целом зародыше, но и в изолированных бластомерах, логично предположить существование какого-то механизма клеточной природы, действующего одновременно во всех клетках зародыша и выполняющего функцию биологических часов.
Предположение о том, что в установлении этой ритмики играют роль деления дробления у X. laevis было отвергнуто опытами с цитохалазином, который подавлял цитотомию, но не влиял ни на синтез ДНК, ни на время наступления активации процессов синтеза РНК. Как и в условиях нормального развития, изменения параметров синтеза нуклеиновых кислот в опытах с цитохалазином наблюдались лишь через 6 ч после оплодотворения.
Время изменения свойств бластомеров X. laevis (так называемая точка перехода на стадии средней бластулы, или МВТР, mid blastula transition point) не зависит и от синтеза РНК. Если использовать ингибитор синтеза РНК аманитин на стадии средней бластулы, то синтез РНК подавляется на 80-100%. Если же воздействовать аманитином на яйцо Xenopus, то дробление вдет нормально, и изменение его частоты происходит, как и в контроле, на 12-м цикле.
Наступление точки перехода на стадии бластулы не зависит и от числа прошедших раундов синтеза ДНК. Это было показано в эксперименте, в котором на яйцо накладывали лигатуру и после начала дробления одну половину яйца в течение двух циклов сохраняли безъядерной. Затем, ослабив лигатуру, пропускали ядро в недробившуюся половинку яйца. При этом оказалось, что точка перехода в этой половине наступала на два клеточных цикла позднее. Другими словами, в той половине, где дробление начиналось раньше, точка перехода приходилась на 12-й цикл репликации, а в другой, где дробление задерживалось, на 14-й цикл.
Из этих наблюдений следует, что критическим параметром, контролирующим наступление точки перехода, может быть ядерно-цитоплазматическое отношение. В пользу такого предположения говорит и то, что точка перехода в гаплоидных яйцах наступает на один цикл позднее, тогда как при искусственно вызванной полиспермии, увеличивающей исходное количество ДНК примерно в 4 раза, начало активного синтеза РНК наблюдали на два цикла раньше, чем в норме. Связь между нормализацией ядерно-цитоплазматического отношения и началом транскрипционной активности развивающегося зародыша впервые была исследована известным московским эмбриологом А. А. Нейфахом (1926-1997).
Таким образом, наступление точки перехода на стадии средней бластулы у низших позвоночных животных определяется ядерно-цитоплазматическим отношением или, возможно, соотношением количества ДНК и цитоплазмы. Высказано предположение, что в яйце имеется цитоплазматический компонент, который служит ингибитором какой-то ключевой реакции, необходимой для активации таких разнородных функций, как синтез РНК, клеточное движение и события клеточного цикла, и вместе с тем имеет сродство к ДНК. Согласно этой гипотезе (гипотеза «истощения») каждое ядро связывает определенное количество ингибитора, и образующиеся в ходе дробления ядра как бы «титруют» цитоплазму. При увеличении концентрации ДНК, обусловленном отсутствием компенсаторного роста бластомеров, по мере дробления происходит уменьшение концентрации ингибитора до некоего порогового значения, достижение которого и знаменует собой точку перехода (МВТР.)
Гипотеза истощения нашла свое подтверждение в опытах с инъекцией плазмиды с дрожжевым геном транспортной РНК в оплодотворенное яйцо X. laevis. В период дробления транскрипция инъецированной дрожжевой т-РНК прекращалась, что указывало на наличие ингибитора в цитоплазме ооцита. После прохождения МВТР синтез РНК восстанавливался. Если же в яйцо инъецировали большие количества экзогенной ДНК, супрессии транскрипции не происходило, как предполагалось, из-за связывания ингибитора с избыточной экзогенной ДНК.