Предварительные опыты. Порции в одну треть или половину яичника крысы, быстро или медленно замороженные при —79 или —196° (в высушенном состоянии или в 15-процентном растворе глицерина), в большинстве случаев не приживали у животных, которым была проведена аутотрансплантация. В связи с этим в методику опыта внесли некоторые изменения.
Яичники перед погружением в физиологический раствор, содержащий 15% глицерина, крошили на мелкие кусочки, чтобы облегчить проникновение глицерина в клетки. Спустя 1— 2 час пробы замораживали при —79°, затем оттаивали и трансплантировали. Медленно охлажденная ткань сохраняла эндокринную активность у обеих крыс, которым ее имплантировали, тогда как с быстро замороженной тканью получали отрицательные результаты.
Было проведено несколько серий опытов, в которых тщательно измельченную в различных средах ткань яичника медленно охлаждали до —79 или —196°. Результаты этих опытов показали, что взвеси ткани яичника, медленно охлажденные до —196° в среде, содержащей 15% глицерина, неизменно давали активные трансплантаты, но латентный период до появления эндокринной активности был почти в два раза больше, чем при аутотрансплантации незамороженной ткани. Взвеси ткани яичника в сыворотке без глицерина переживали охлаждение до —79, но не до —196°.
Разрушение ткани после оттаивания. Интересно отметить, что ткань яичника разрушалась при хранении ее при комнатной температуре после оттаивания. Когда между оттаиванием после замораживания в жидком воздухе и имплантацией проходило 2 час, из 10 аутотрансплантатов только 4 сохраняли эндокринную активность. При этом интервал времени между имплантацией и наступлением ороговения клеток во влагалищном мазке увеличивался до 29 дней. В описываемых опытах ткань яичника взвешивали в 0,85-процентном растворе NaCl, содержащем 15% глицерина. Позднее Паркс показал, что выдерживание в течение 3 час при температуре +20° после оттаивания и перед имплантацией полностью разрушает ткань яичника, замороженную в физиологическом растворе, содержащем глицерин, но лишь незначительно снижает выживаемость этой ткани при замораживании ее в сыворотке, содержащей 15% глицерина. Еще более сильное разрушение ткани после оттаивания наблюдалось, когда материал, замороженный в физиологическом растворе с глицерином, переносили в среду, содержащую лошадиную сыворотку, или материал, замороженный в сыворотке с примесью глицерина, переносили в физиологический раствор с глицерином.
Разрушение при температуре —79°. Другое неожиданное, но чрезвычайно важное открытие заключалось в том, что ткань яичника разрушалась в первые 10 дней хранения при —79°. Ткань, взвешенная в 0,85-процентном физиологическом растворе, содержащем 25% глицерина, и согретая после хранения в течение 1 час при температуре —79°, давала активный аутотрансплантат в среднем через 16,5 дня у всех 4 крыс, которым она была имплантирована. В то же время ткани, обработанные таким же путем, но хранившиеся при температуре —79° в течение 9 дней, не дали ни одного активного трансплантата через 28 дней. При хранении в среде, содержащей сыворотку, ткани разрушались в меньшей степени, хотя разрушение и имело место.
При увеличении продолжительности хранения с 9 до 83 дней в условиях температуры —79° в физиологическом растворе, содержащем 15% глицерина, ткани не утрачивали своей потенциальной жизнеспособности.
Поразительно, что обработанная глицерином ткань яичника, охлажденная до —190° и хранившаяся при этой температуре, мало подвергалась разрушению. Продолжительность хранения при температуре жидкого воздуха (1 час или 9 дней) не играла особой роли: различия в соотношении животных, у которых трансплантаты сохранили активность, а также разница в интервале времени между моментом имплантации и появлением эндокринной активности ткани были весьма незначительными. Полученные результаты показывают, что в ткани, хранившейся при —79°, наступали изменения, которые при —190° полностью прекращались или сильно замедлялись. Вряд ли эти изменения были связаны с химическими реакциями, протекающими очень медленно при температуре —79°. Скорее здесь имели место физические повреждения.
Особый интерес вызывает тот факт, что ткань яичника, переносившая в отсутствие глицерина температуру —79°, разрушалась при —190°. Этого и следовало ожидать, учитывая результаты культивирования яйценосного бугорка. Окончательно было подтверждено, что в интервале температур от —79 до —190° в тканях происходят определенные физические изменения, которые вызывают повреждения клеток и которые можно предотвратить глицерином.
Увеличение концентрации глицерина от 15 до 25% не повышало функциональной жизнеспособности ткани яичника, подвергавшейся в течение 1 час или 9 дней воздействию температуры —79 или —190°. В то же время было получено некоторое указание, впоследствии подтвержденное, что при температуре хранения яичников —79° сыворотка представляет собой лучшую среду, чем 0,85-процентный раствор хлористого натрия, независимо от наличия или отсутствия глицерина.
Продолжительное хранение в жидком воздухе. Следующая задача заключалась в исследовании влияния продолжительного хранения на замороженную ткань яичника. В качестве объектов для аутотрансплантации яичников брали неполовозрелых крыс весом 60 г. Этим уменьшалась возможность смерти крыс от старости во время проведения опыта. Яичники мелко крошили в физиологическом растворе, содержащем 15% глицерина, медленно охлаждали до —79°, хранили при температуре 190° в течение различного периода времени до 1 года и затем имплантировали под кожу. Полученные результаты показывают, что увеличение продолжительности хранения от 1 час до 1 года почти не усиливало повреждения ткани яичника, вызываемого замораживанием и оттаиванием.
Упрощение методики. Применение автоматического прибора для медленного охлаждения давало почти такие же результаты, как и ступенчатое охлаждение ампул с тканью яичника в холодных банях. Поэтому для повседневной работы было принято это упрощение.
Оставались неразрешенными две более сложные проблемы: как избежать трудоемкого процесса измельчения ткани яичника в стерильных условиях и как сократить расход жидкого воздуха, запас которого необходимо было ежедневно пополнять? На второй год хранения ткани при —190° произошли неполадки и некоторые ампулы, как выяснилось, были случайно согреты, так что их пришлось выбросить, а материал других при аутотрансплантации давал неудовлетворительные результаты. Результаты исследований показывают, что ткань яичника, разрезанного на 4 части, переживает замораживание при —79 и —190°. Число животных, у которых трансплантаты прижили, немногим отличалось от числа животных в опытах, в которых в аналогичной среде замораживали мелко изрубленную ткань. Не сильно удлинялся и латентный период между имплантацией ткани и появлением признаков активности. Эти результаты показывают также превосходство сыворотки (как разбавителя глицерина) над физиологическим раствором независимо от температуры замораживания ткани (—79 или —190°). Доля животных с прижившими трансплантатами слегка уменьшалась, а латентный период удлинялся, когда подсадочный материал хранили в течение 1 недели не при —190, а при —79°.
Учитывая все сказанное, в последующих опытах яичник разрезали на 4 части, взвешивали в сыворотке, содержащей 15% глицерина, охлаждали до —79° и хранили при этой температуре различное время от 1 до 48 недель. Полученные результаты показывают, что хранение в течение 1—26 недель не повлияло на долю крыс с прижившими аутотрансплантатами и не удлинило латентный период времени между имплантацией ткани и восстановлением активности. После 48-недельного хранения при —79° этот период был уже значительно больше. Однако ткань яичника, хранившаяся 70 недель при —79° в сыворотке с глицерином, давала функционально активные и нормальные в гистологическом отношении трансплантаты.
Как известно, важным компонентом одной из обычных сред, применяемых для консервации обработанных глицерином сперматозоидов быка при температуре —79°, является яичный желток. Однако, когда разрезанные на 4 части яичники взвешивали в 15-процентном растворе глицерина в яичном желтке, охлаждали до —79° и хранили при этой температуре в течение различного времени от 1 недели до 1 месяца, доля крыс, у которых за 28 дней восстановилась функциональная активность аутотрансплантатов, снизилась. В некоторых случаях эндокринная активность восстановилась лишь спустя 3—8 месяцев после имплантации.
Гораздо проще было бы хранить ткань яичника при температурах, создаваемых обычными холодильниками, применяемыми в быту, а не при температуре твердой углекислоты. Однако хранение при температуре —20° в сыворотке с глицерином не давало удовлетворительных результатов, и ткань, имплантированная через 8 дней хранения при этой температуре, была нежизнеспособной.
Влияние изменения концентрации и длительности обработки глицерином. Оптимальная концентрация глицерина для защиты сперматозоидов быка от повреждающего действия замораживания при —79°, хранения при этой температуре и оттаивания составляет приблизительно 6—10% в зависимости от концентрации других компонентов среды и точного соблюдения методики охлаждения. Действие более низких концентраций глицерина испытывали на яичниках крысы, разрезанных на 4 части, охлажденных до —79° и хранившихся при этой температуре в течение 24 час до аутотрансплантации.
В проведенных опытах ни один из трансплантатов, замороженных в отсутствие глицерина, не приживал. Значительно лучшие результаты были получены при содержании в среде 5% глицерина, еще лучшие — при 10% и самые лучшие — при 15%, судя по доле животных с физиологически активными трансплантатами и по продолжительности латентного периода. Степень повреждений, связанных с понижением концентрации глицерина, не увеличивалась при удлинении срока хранения с 24 час до 1 месяца.
Когда кусочки яичника перед замораживанием подвергали воздействию глицерина в течение 18 час в условиях комнатной температуры, ни один из трансплантатов не прижил после оттаивания. Если обработку глицерином проводили при 2°, а не при комнатной температуре, то результаты трансплантации также были неудовлетворительными. Сокращение продолжительности обработки глицерином при комнатной температуре до 3—17 мин улучшило результаты, судя по среднему латентному периоду до проявления активности трансплантатов. Непродолжительная обработка глицерином допускала применение более высоких концентраций без повреждения тканей.
Скорость охлаждения. В противоположность сперматозоидам быка ткань яичника крысы, взвешенная в сыворотке с 15% глицерина, не повреждалась при резком охлаждении в пределах температур выше нуля, но полностью или почти полностью утрачивала жизнеспособность в результате быстрого охлаждения от 0 до —79°. Поэтому ткань яичника, предназначенную для трансплантации, пропитывали сывороткой, содержащей 15% глицерина, в течение 15 мин или 1 час, а затем подвергали быстрому двухступенчатому охлаждению.
Результаты показывают, что быстрое двухступенчатое охлаждение меньше вредит тканям, которые перед замораживанием в течение 1 час обрабатывали глицерином, чем охлаждение до —79° в один прием. Однако доля животных с прижившими, функционально активными трансплантатами была значительно меньше, а латентный период дольше, чем в предыдущих опытах, в которых проводили постепенное охлаждение от 0 до —79°.
Защитное действие других нейтральных растворимых веществ. Помимо глицерина, многие другие нейтральные растворимые вещества оказывают некоторое защитное действие на сперматозоиды быка и эритроциты человека в процессе замораживания при очень низких температурах и последующего оттаивания. Однако до настоящего времени не удалось открыть соединение, которое лучше бы защищало эти клетки или было бы менее токсичным при эффективной концентрации, чем глицерин.
Подобные же результаты были получены и в опытах на ткани яичника крысы. Многоатомные спирты — пропилен-, этилен — и диэтиленгликоль — хорошо защищали ткань при охлаждении до —79° и хранении при этой температуре в течение 24 час, но ни одно из этих соединений не было столь эффективным, как глицерин.
Кусочки же яичника, обработанные метанолом, моноэтиловым эфиром диэтиленгликоля или карбоваксом и замороженные при —79°, при имплантации животным совершенно не давали активных аутотрансплантатов. Кусочки яичника, взвешенные в 10-процентном растворе метанола, переживали воздействие температуры —20° в течение 3 час независимо от скорости охлаждения. Однако после 18 час хранения при этой же температуре они ни у одной из крыс, которым их имплантировали, не образовали активного трансплантата. Защитное действие метанола было испытано также в условиях промежуточных температур в целях консервации тканей методом лиофилизации. Только в тех случаях, когда процесс высушивания длился несколько дней, из кусочков яичника, замороженных при —79°, удавалось удалить молекулы льда путем возгонки в вакууме. В то же время в диапазоне температур от —10 до —40° возгонка льда совершалась в течение нескольких часов. Метанол представляет собой относительно летучее соединение и полностью удаляется приблизительно за такой же период времени. Остается не ясным, сохранит ли ткань яичника крысы жизнеспособность после ее последующего увлажнения. Воздействие неразбавленным глицерином в условиях комнатной температуры на обработанную глицерином лиофилизироваиную ткань почти несомненно вызовет необратимые повреждения фолликулярных клеток.
pH среды. Большое влияние на выживаемость эндотелия роговицы и других обработанных глицерином замороженных и согретых тканей оказывает pH защитной среды. В крысиной сыворотке, содержащей 15% глицерина, pH составлял 7,8. Путем добавления в эту среду бикарбоната натрия или уксусной кислоты и ацетата натрия исследовали влияние pH на жизнеспособность ткани яичника. Полученные результаты показывают, что выживаемость замороженной ткани яичника несколько повышалась при доведении pH до 6,8. Увеличение щелочности до pH 8,8, оптимального для эндотелия роговицы, уменьшало долю животных с прижившими трансплантатами. Увеличение кислотности до pH 5,8 или 4,8 оказывало еще более вредное влияние.
Облучение замороженной ткани яичника. Разрезанные на 4 части яичники крысы, взвешенные в физиологическом растворе с добавлением 15% глицерина, облучали при комнатной температуре. Ткань, получившая дозу 1000 г, хорошо приживала после имплантации, тогда как получившая дозу 6600 г не дала ни одного трансплантата. При воздействии дозой 3300 г наблюдался промежуточный результат, и у небольшого числа животных были получены активные трансплантаты, но после несколько более продолжительного латентного периода.
В других опытах яичники крысы, разрезанные на 4 части и взвешенные в такой же среде, охлаждали до —79°, затем при этой же температуре облучали при дозе 3300 г, а после оттаивания проводили аутотрансплантацию. Полученные результаты убедительно показывают, что при —79° облучение меньше повреждало эндокринную ткань яичника, чем в условиях комнатной температуры. Однако сравнение с контрольным материалом, замороженным, но необлученным, выявляет, что и здесь вредное действие облучения полностью не было исключено.