Эритромицин представляет собой продукт жизнедеятельности Act. erythreus. По химической природе он относится к группе антибиотиков, называемых макролидами.
Строение этих антибиотиков характеризуется наличием в их молекуле крупных полиоксилакатонных колец (C12 и более атомов). В состав эритромицина входит лактонная группировка (эритронолид), соединенная с аминосахаром дезозамином (диметиламиногексоза) и кладинозой. В настоящее время выделено три эритромицина А, В и С. В отличие от эритромицина А у эритромицина В у двенадцатого углеродного атома отсутствует гидроксильная группа, у эритромицина С — метоксильная группа кладинозы. По своей активности in vitro эритромицины В и С ниже, чем эритромицин А. Торговый препарат содержит все три типа эритромицина, с преобладанием эритромицина А.
Механизм биосинтеза молекулы эритромицина. Woodward (1957) предположил, что длинные углеродные цепи лактонных группировок, входящих в состав антибиотиков-макролидов, могут строиться путем ступенчатого присоединения ацетатных или эквивалентных им групп при участии коэнзима А. Аналогией для этого служил синтез длинных углеродных цепочек жирных кислот. Однако в отличие от синтеза жирных кислот в реакциях биосинтеза антибиотиков-макролидов принимают участие молекулы пропионилкоэнзима А, а не ацетилкоэнзима А. Путем применения пропионовой кислоты, меченной по углероду в трех различных положениях, была подтверждена теория Вудворда.
Определенный интерес представляет вопрос о порядке расположения углеродных атомов пропионовой кислоты в эритронолиде: третий углеродный атом метильной группы пропионовой кислоты располагался в боковой цепи; второй — занимал положение четных углеродных атомов, а первый — нечетных.
Corcoran (1966) выдвинул теорию, согласно которой, помимо пропионовой кислоты, в удлинении цепи эритронолида принимает участие метил-малонил в виде своего коэнзимпроизводного. В отличие от синтеза жирных кислот при синтезе эритронолида в цепи сохраняется больше атомов кислорода, так как, вероятно, в реакциях не участвует НАДФ—Н2, за счет которого происходит восстановление R—С — группировки. Известно, что метилмалонил является веществом, которое образуется в результате метаболизма некоторых аминокислот.
Не исключена возможность, что микроорганизмы так же, как и животные, обладают способностью присоединять СO2 к молекуле пропионил-КоА с образованием метилмалонилкоэнзима А.
Одним из промежуточных продуктов синтеза, очевидно, является эритронолид В, к которому далее присоединяются два углеводных компонента, после чего он принимает характер глюкозида. После гидроксилирования у 12-го углеродного атома из эритромицина В образуется эритромицин А. Последний может перейти в эритромицин С, если произойдет деметилирование метоксильной группы кладинозы.
Предполагают, что в случае участия в реакциях метилмалоновой кислоты первоначально может происходить перенос карбоксильной группы метилмалонсгвой кислоты на пропионовую с образованием янтарной кислоты и новой молекулы пропионовой кислоты, которая собственно входит в эритронолид.
Теория Corcoran лучше, чем теория Woodward, объясняет образование боковых метальных групп и механизм удлинения цепи.
В связи с несомненным фактом участия пропионовой кислоты в синтезе полезно рассмотреть возможные пути ее образования в культурах актиномицетов. Тем более, что при отсутствии пропионовой кислоты в среде биосинтез эритромицина все же происходит. Этот факт может служить косвенным доказательством того, что Act. erythreus в процессе обмена веществ может образовывать пропионовую кислоту. Через какие промежуточные продукты происходит синтез пропионовой кислоты актиномицетами — не установлено. По аналогии с другими микроорганизмами предполагают, что она образуется либо при декарбоксилировании янтарной кислоты, либо при восстановлении пировиноградной кислоты через молочную и акриловую кислоты.
В указанных реакциях принимают участие коэнзим А. В частности, известно, что янтарная кислота в виде сукцинил-коэнзима А декарбоксилируется с образованием пропионил-коэнзима А. Акриловая кислота также выступает в реакцию в виде акрилат-коэнзима А. Однако результаты опытов С. Л. Бринберг (1959) по изучению влияния янтарной кислоты на биосинтез эритромицина заставили ее прийти к выводу, что Act. erythreus 8594 не имеет ферментной системы, декарбоксилирующей янтарную кислоту до пропионовой кислоты.
При использовании «меченой» пропионовой кислоты как компонента среды радиоактивность в дезозамине и кладинозе практически не обнаруживалась. Наличие в составе молекулы эритромицина большого количества метальных групп давало основание применить меченный по С14Н3-метионин. Анализ радиоактивности продуктов гидролиза антибиотика показал, что метальные группы включаются в дезозамин у атома азота и в кладинозу, образуя метальную группу, но не метоксильную. На ранних этапах развития культуры дезозамин присутствует в мицелии в свободном состоянии, затем исчезает и обнаруживается в составе молекулы антибиотика.
Ферментация. Получение эритромицина путем ферментации может осуществляться на различных комплексных средах, содержащих соевую муку, кукурузный экстракт, арахисовую муку, крахмал, сахарозу, сульфат аммония, фосфаты и т. д. Концентрации каждого из ингредиентов зависят от штамма, технологического оборудования и т. д. В качестве примера могут быть приведены прописи сред, предложенные некоторыми исследователями.
Синтетические среды при ферментации эритромицина, как и для большинства антибиотиков, в промышленности не применяются, а используются в исследовательских целях для выяснения роли отдельных ингредиентов на биосинтез антибиотика.
Процесс ферментации по своим биохимическим показателям (динамика изменения количественного содержания углеводов, азота, фосфатов) не имеет каких-либо специфических особенностей, свойственных биосинтезу эритромицина. Использование углеводов и азота начинается немедленно и сопровождается быстрым ростом мицелия. К концу вторых суток, т. е. ко времени идентификации эритромицина в среде, практически заканчивается увеличение биомассы. Предполагают, что биосинтез не зависит от процесса роста мицелия. Smith (1962) было показано, что на комплексной среде только тогда возможен синтез, когда введенный в среду источник азота оказывается полностью израсходованным.
Составной частью всех сред, применяемых при ферментации, являются пропиловый спирт, водорастворимые амиды пропионовой кислоты или ее натриевая соль. Высокие концентрации пропионата токсичны для мицелия, поэтому применять его следует в ограниченных количествах, установленных опытным путем. Пропионат, или пропиловый спирт, целесообразно вводить на ранних этапах ферментации. Сравнительные данные по изучению радиоактивности эритромицина показывают, что «меченый» пропионат, введенный на 96-м ч ферментации, обнаруживается в молекуле антибиотика в меньших количествах (22,3 мк Ci 10-2) мк М, чем введенный в начале ферментации (42,7 мк Ci 10-2) мк М. Вероятно, синтез эритромицина начинается на более ранних этапах, чем удается обнаружить в среде эритромицин.
Существенное влияние на развитие продуцента и биосинтез антибиотика оказывает содержание фосфатов в среде. Избыток фосфора оказывает угнетающее действие на рост и биосинтез в том случае, если избыток приходится на первую фазу ферментации. Избыток фосфора во второй фазе не оказывает подобного влияния.
Высокие концентрации железа подавляют биосинтез эритромицина. Вероятно, здесь имеет место процесс образования перекисей за счет ненасыщенных связей масел, используемых в качестве пеногасителей. Аналогичное явление наблюдается при биосинтезе тетрациклиновых антибиотиков.
Опыты на синтетических средах по изучению влияния углеводов на образование эритромицина показали, что наиболее предпочтительным была сахароза. Она расщеплялась в среде до глюкозы и фруктозы. Глюкоза использовалась первой, затем — фруктоза. При использовании только одной глюкозы быстрый рост культуры сопровождается резким падением pH и ранним автолизом культуры вследствие быстрого истощения питательных веществ среды. В прописях некоторых сред рекомендуется применять глюкозу вместе с крахмалом.
Условия, которые способствуют синтезу определенного типа эритромицина (А, В или С), достаточно хорошо еще не изучены.