Замечательные механизмы для улавливания нематод, имеющиеся у хищных грибов, представляют собой относительно мало изученную область исследований.
Этот факт может показаться странным, пока мы не вспомним, что даже ботаники все еще очень мало знакомы с этими грибами. Та работа, которая была проведена, относилась главным образом к вопросу образования и действия ловушек, представляющих собой сжимающие кольца, и в меньшей степени к клейким головкам и сетям.
Одним из наиболее ранних исследователей, работавших в этой области, был американский ученый Дж. Н. Коуч, который 20 лет назад исследовал сжимающие кольца гриба Dactylella bembicodes. Он получал этот гриб из частично сгнившей сосновой древесины, где тот уничтожал свободно живущих нематод, которые в изобилии встречаются в подобном материале. Первой задачей исследователя было выделение гриба в чистой культуре — другими словами, получить его развивающимся самим по себе, без примеси бактерий, других грибов, нематод и т. д. В коричневатой жидкости, просачивающейся из разлагающейся древесины, Dactylella bembicodes был лишь одним из микроорганизмов, и его выделение по необходимости должно было предшествовать опыту.
Это выделение было легко осуществлено путем использования спор гриба. Гриб D. bembicodes размножается при помощи мельчайших яйцевидных спор, известных под названием конидий, из которых каждая помещается на верхушке длинного «стебелька», или конидиеносца. Слово «длинная» употреблено здесь в относительном смысле, потому что длина конидиеносцев составляет лишь около 1,7 мм, тогда как длина самой споры составляет около 1,2 мм. Тем не менее при рассмотрении под микроскопом конидиеносцы производят впечатление шестов для флагов, а конидии на их верхушках похожи на привязанные воздушные шары, так что совсем нетрудно подцепить отдельную конидию на кончик очень тонкой иголки и перенести ее на поверхность стерильного агара, находящегося в стеклянной чашке, снабженной крышкой. Здесь споры прорастают, подобно семенам, и образуемой ими мицелий гриба будет свободен от загрязнения другими организмами.
Когда D. bembicodes выращивали в такой чистой культуре, то заметили странное явление. Гриб разрастался, подобно любой обыкновенной плесени, мицелий его состоял из длинных ветвящихся гиф, покрывавших поверхность агара и не обнаруживавших никаких признаков характерных колец, служащих ловушками для нематод. При выращивании в чистой культуре гриб О. bembicodes производит впечатление безвредной плесени. Поскольку здесь отсутствуют нематоды, кольца для их улавливания не нужны и не образуются. Этот факт уже был известен Дречслеру, открывшему этот гриб. Однако когда к чистой культуре добавляли немного коричневатой жидкости из той чашки, где первоначально выращивали гриб вместе с нематодами, у гриба пробуждалось сознание ответственности и начиналось образование множества колец. Очевидно, в этой жидкости имелось что-то такое, что побуждало гриб к образованию ловушек для нематод.
Жидкость, взятая из первоначальной древесной культуры, оказалась определенно кислой вследствие наличия органических кислот, образующихся при разложении древесины; представляется возможным, что именно эта кислотность оказывала на гриб стимулирующее действие. Для проверки правильности этого предположения чистые культуры Daciylella bembicodes на агаре, содержавшем солодовый сахар с небольшим количеством пептона, обрабатывали фосфорной кислотой различной концентрации. Оказалось, что добавление небольших количеств кислоты не влияло на образование колец, но при повышении концентрации кислоты кольца начинали образовываться.
Эти опыты показали, что повышение кислотности является одним из факторов, которые могут вызвать образование колец у D. bembicodes, выращиваемого в чистой культуре, но это еще далеко не все. Концентрация фосфорной кислоты, необходимая для образования колец, была сравнительно высокая, тогда как в культурах, содержавших нематод, образование колец происходило в условиях значительно меньшей кислотности. Дречслер уже наблюдал, что присутствие нематод, по-видимому, стимулирует образование ловушек, причем маловероятно, чтобы это образование было вызвано содержащейся в культурах кислотой. Хотя опыт, выявивший стимулирующее влияние фосфорной кислоты, дает интересные сведения относительно колец, но он не дает объяснения тому, как они образуются в естественных условиях. Опыты, проведенные позже другими исследователями, значительно расширили наши знания по этому вопросу, но, прежде чем перейти к описанию этих опытов, следует рассмотреть дальнейшую работу, проведенную Коучем.
Наряду с наблюдениями над образованием колец в чистых культурах Коуч изучал действие колец при улавливании нематод. Для того чтобы детально изучить процесс замыкания колец. Коуч сначала приготовлял чистые культуры D. bembicodes, а затем вносил в них нематод. Таким образом, он мог наблюдать под микроскопом процесс улавливания нематод. Он установил, что в молодых и мощных культурах гриба ловушки замыкались очень быстро; в более старых культурах действие колец становилось менее энергичным, а в очень старых культурах они, казалось, совершенно теряли способность замыкаться. Правильность этого наблюдения была впоследствии подтверждена не только для D. bembicodes, но и для ряда других хищных грибов.
Следующий вопрос, па который Коучу следовало найти ответ, был: чем объясняется замыкание кольца? Проникновение нематоды в отверстие кольца каким-то образом стимулирует клетки, составляющие кольцо, и приводит механизм в действие. Энергичные движения нематод наводят на мысль о наличии какого-то механического стимула, и совершенно очевидный подход к разрешению этой проблемы заключался в попытке вызвать введением в кольцо какого-либо инертного предмета тот же эффект, какой вызывает проникновение в него живой нематоды.
Осуществить эту задачу было нелегко. Диаметр отверстия кольца у D. bembicodes меньше 0,025 мм; эти отверстия видимы только под микроскопом, и даже кончик тонкой булавки слишком груб для того, чтобы их зондировать. К счастью, для исследователей существует инструмент, известный под названием «микроманипулятор», предназначающийся для использования именно при подобных обстоятельствах. Этот инструмент состоит в основном из пары держателей, монтированных на штативе и так устроенных, что они могут передвигаться очень медленно и очень осторожно в любом направлении при помощи винтов. К держателям микроманипулятора прикреплены две «иглы», изготовленные из вытянутого стекла и более тонкие, чем какие бы то ни было изделия, изготовленные из металла. Микроманипулятор прикрепляют к предметному столику микроскопа, под которым предполагается рассматривать изучаемый предмет, и приводят в движение стеклянные иглы. При пользовании таким прибором введение тонкой стеклянной иглы в кольцо D. bembicodes почти что детская игра.
Коучу удалось ввести в кольцо стеклянную иглу, которой он двигал взад и вперед, подражая движениям нематоды. Это он делал много раз, но пи разу не пришлось ему отметить что-либо другое, кроме незначительного набухания клеток кольца. Почему это так случалось, трудно понять, так как позже другим исследователям удалось вполне убедительно доказать, что трение или, возможно, давление действительно служит требуемым стимулом. Как бы то ни было, но Коуч не обнаружил замыкания кольца в результате стимуляции стеклянной иглой и был вынужден заключить, что трение не является требуемым стимулом.
Наблюдая под микроскопом и видя, что наиболее отчаянные движения нематод происходят скорее после, чем до замыкания охватывающих их колец, Коуч задавал себе вопрос, не участвует ли в этом какой-либо химический стимул? Может быть, какое-нибудь вещество, выделяемое нематодой вблизи ловушки, вызывает замыкание последней? Поэтому было проведено изучение действия на кольца слабых растворов различных химических веществ, в том числе аммиака, едкого калия, а также ряда как органических, так и неорганических кислот. Здесь Коучу также не удалось вызвать смыкания колец, хотя обработка их 1-процентным раствором молочной кислоты фактически вызвала незначительное набухание клеток.
Здесь следует упомянуть о последнем наблюдении Коуча, а именно о наблюдении, согласно которому замыкание клеток может быть вызвано воздействием высокой температуры. Капая на кольца нагретой дистиллированной водой, Коучу удалось доказать, что они смыкаются при контакте с водой, нагретой до любой температуры между 33 и 75°. Ниже 30° набухание не происходило, температуры же, превышавшие 80°, вызвали гибель клеток. Поскольку для опыта пользовались дистиллированной водой, здесь не могло иметь место предположение, что какие-либо посторонние примеси в воде оказывают это действие. Совершенно ясно, что в естественных условиях вряд ли может иметь место действие высокой температуры — если только нематода не болеет лихорадкой! Однако наблюдение это интересно и может в конечном итоге повлиять до некоторой степени на разрешение очень трудного вопроса: что является причиной набухания клеток?
От рассмотрения работы Коуча мы переходим теперь к рассмотрению одного из наиболее увлекательных исследований, проведенных с хищными грибами, а именно работы Дж. Командона и П. де Фонбрюна, проведенной в Пастеровском институте непосредственно перед началом второй мировой войны. Во Франции недавно был сконструирован новый улучшенный вид пневматического микроманипулятора, чувствительность которого делала возможным обращение с материалом при рассмотрении под микроскопом с наиболее сильным увеличением. Такая работа требует чрезвычайной осторожности. Если бы кончик минутной стрелки па ручных часах можно было бы наблюдать под микроскопом с увеличением в 1000 раз (обычное увеличение для такого прибора), то он пересек бы поле зрения микроскопа немного более чем за 1 сек. Поэтому понятно, что если предполагается рассматривать и по желанию перемещать такие объекты, как нематоды и сжимающие кольца, то для этого необходимо использование самых тонких механических приборов; оператор, пытающийся работать без такой помощи, напоминал бы пьяного бронтозавра в перчатках для бокса, пытающегося продеть нитку в ушко иголки, причем преимущество все-таки было бы на стороне бронтозавра.
В пневматическом микроманипуляторе Командона и де Фонбрюна используются небольшие различия в давлении воздуха для управления чрезвычайно точными движениями. Пользуясь, этим прибором, они не только могли перемещать кольца в желаемые положения, но и подхватывать живую нематоду и проталкивать ее в кольцо, несмотря на ее энергичное сопротивление, избегая таким образом необходимости терпеливо дожидаться у микроскопа, пока нематода не будет поймана обычным, случайным путем. Для манипуляций с нематодами пользовались, микропипеткой — очень тонким полым стеклянным волоском, через который можно производить всасывающее действие. Диаметр отверстия пипетки был немногим меньше диаметра нематоды, т. е. порядка 0,05 мм. При помощи микроманипулятора кончик пипетки подводили к хвостовому концу ничего не подозревающей нематоды и, применяя всасывающее действие как раз в нужный момент, втягивали ее хвостовой конец в трубку, из которой выступал головной конец нематоды. Затем можно было просунуть голову нематоды в кольцо и даже потереть ее тела о внутреннюю поверхность кольца для того, чтобы проверить, будет ли это способствовать набуханию клеток.
Командой и де Фонбрюн исследовали не только сжимающие кольца, но также и некоторые из механизмов, обусловливающих прилипание. Для исследований они использовали 5 различных грибов: Dactylaria brochopaga и Daciylella bembicodes, оба со сжимающими кольцами; Arthrobotrys oligospora с клейкими головками; Dactylella ellipsospora с клейкими головками и Stylopage hadra — более простой хищный гриб, у которого, как уже было сказано выше, весь мицелий отличается клейкостью. Первые 4 вида грибов были выделены в чистую культуру и выращивались на агаре с добавлением пивного сусла, препарата, приготовленного из агарового желе с добавлением пивного сусла и распаренного овса в качестве пищи для гриба. Stylopage hadra является облигатным хищником, т. е. он не может расти без необходимой для него животной пищи, а потому не может быть выделен.
Для того чтобы быть уверенным в том, что наличие посторонних животных не нарушит условий опыта, эти исследователи решили работать с нематодами, стерильными в микробиологическом смысле, т. е. свободными от загрязнения бактериями или какими-либо другими организмами. Для получения стерильных нематод их яйца были выделены из почвенных культур и простерилизованы путем погружения в раствор соли хлорноватистой кислоты, за которым следовало промывание водой. Через несколько часов из яиц вышли личинки, и оказалось, что молодые нематоды могут в течение нескольких дней жить на агаре, не будучи загрязнены бактериями.
Когда для этих опытов грибы выращивали в чистых культурах, то было немедленно отмечено, что они не образуют ловушек для нематод, за исключением Dactylella ellipsospora, который иногда образовывал клейкие головки и при отсутствии нематод. Добавление к культурам нематод вскоре приводило к появлению ловушек. Было также обнаружено, что добавление небольшого количества воды, в которой жили стерильные нематоды, было достаточным для стимуляции образования ловушек. Это указывает на то, что некоторое вещество, образуемое нематодами, растворилось в воде и что это вещество воспринимается грибами в качестве заменителя нематод. При кипячении вода теряла свою активизирующую способность, так же как и суспензия мертвых нематод; очевидно, таинственное активизирующее вещество разрушается под влиянием нагревания. По-видимому, это какое-то неустойчивое химическое соединение.
По окончании этих предварительных наблюдений были начаты опыты по изучению действия сжимающих колец. В большинстве опытов был использован гриб Dactylaria brochopaga, но, по-видимому, кольца гриба Dactylella bembicodes не отличались сколько-нибудь существенно от колец D. brochopaga ни по своей структуре, ни по способу действия. Для того чтобы материалом можно было управлять при помощи микроманипулятора, была приготовлена микрокультура путем помещения нескольких спор гриба на тонкую мембрану целофана, вымоченного в питательном растворе и разложенного под покровным стеклом — одним из очень тонких кусков плоского стекла, используемых для покрытия образцов при изучении их под микроскопом. Споры проросли, и мицелий гриба распространился по целофану; когда он достаточно разросся, к микрокультуре были добавлены стерильные нематоды. Примерно через 24 часа после внесения нематод на грибе начали появляться сжимающие кольца, число которых увеличилось после того, как было поймано несколько нематод, как будто первый успех оказал на гриб поощряющее влияние в отношении образования следующих колец.
Для изучения способа улавливания нематод была использована микропипетка. Нематоду удерживали за хвостовой конец путем всасывания в отверстие кончика пипетки, а голову осторожно вводили в отверстие кольца. Когда внутреннюю поверхность кольца осторожно терли нематодой, три клетки, составляющие кольцо, быстро вздувались и плотно охватывали животное, настолько плотно, что при потягивании его мицелий гриба можно надо оторвать, не освобождая попавшую в плен нематоду. Набухание клеток кольца хронометрировали при помощи кинематографической пленки, причем оказалось, что этот процесс, раз начавшись, занимает меньше 1/10 сек.
В следующую очередь следовало выяснить, вызывает ли реакцию колец контакт с какими-нибудь другими предметами, помимо нематод. Для этого была использована очень тонкая стеклянная игла, укрепленная в микроманипуляторе; клетки кольца слегка поглаживали кончиком иглы, что следовало производить с большой осторожностью. Оказалось, что поглаживание внешней стороны кольца не вызывало никакой реакции, если же иглу вводили в отверстие кольца и осторожно поглаживали внутреннюю поверхность одной из трех клеток, то эта клетка быстро набухала по направлению внутрь кольца. Остальные две клетки кольца обычно реагировали на какую-то долю секунды позже, хотя до них не дотрагивались; этот факт свидетельствует не только о том, что набухание клеток можно стимулировать путем контакта с неживым объектом, но и о том, что этот стимул может передаваться от клетки к клетке.
Открытие Командона и де Фонбрюна о реакции кольца на трение, осуществляемое стеклянной иглой, прямо противоположно наблюдениям Коуча, которому не удалось заставить кольца Dactylella bembicodes сомкнуться в результате такого воздействия. Причина такого расхождения неясна. Не может быть никакого сомнения в правильности наблюдения французских ученых, потому что на кинематографической пленке, заснятой ими, ясно видны кольца, сжимающиеся вокруг микроиглы. Этот фильм, являющийся шедевром кинематографического искусства, настолько ясен во всех подробностях, что здесь невозможно какое бы то ни было неправильное толкование. Вероятно, культуры, использованные в опытах Коуча, были почему-либо менее чувствительны, чем культура Командона и де Фонбрюна; это вполне возможно, потому что хищные грибы могут быть временами темпераментными созданиями, как это может засвидетельствовать всякий, кому приходилось с ними работать. Процесс улавливания нематод, который был заснят на кинематографической пленке, не только дал возможность французским ученым определить период времени, требующийся для завершения набухания, но и помог им получить сведения относительно того, что происходит внутри клеток кольца во время их реакции. Было установлено, что набухание сопровождается быстрым увеличением объема ряда вакуолей — мелких, заполненных жидкостью полостей протоплазмы, имеющихся в клетках кольца. Это расширение вакуолей не совпадало с набуханием клеток, образующих кольцо, а происходило обычно на несколько секунд позже; значение такого расширения вакуолей еще не получило объяснения, но нельзя не предположить, что оно каким-то образом тесно связано с действием колец.
Выше уже было указано, что нематода, захваченная одним из несжимающих колец Dactylaria Candida или какого-либо родственного ему гриба, может освободиться, оторвав кольцо от его основы, но что и в этом случае оторванное кольцо не только убивает нематоду совершенно так же, как если бы оно не отрывалось, но, кроме того, может послужить исходным материалом для образования нового мицелия. Командону и де Фонбрюну удалось доказать при помощи микроманипулятора, что и сжимающее кольцо может вести себя таким же образом. Они установили, что если нематоду, удерживаемую одним из сжимающих колец, оторвать вместе с кольцом и перенести на стерильный агар, то гриб захватывает нематоду обычным способом, а затем от кольца отрастают гифы, которые, развиваясь, образуют обильную поросль мицелия. То обстоятельство, что это не случается самопроизвольно, по крайней мере в широком масштабе, вероятно, объясняется более прочным строением сжимающих колец по сравнению с кольцами несжимающегося типа, а также более сильным повреждением нематоды, плотно охваченной клетками кольца.
Методы, использованные Командоном и де Фонбрюном при изучении действия сжимающих колец, были ими применены при исследовании клейких ловушек грибов Arthrobotrys oligospora и Daciylella ellipsospora, а также клейкого мицелия гриба Stylopage hadra. Было установлено, что в отличие от остальных грибов Daciylella ellipsospora иногда образует свои прилипающие головки на ножках в чистой культуре, хотя он образует их в гораздо больших количествах в культурах, зараженных нематодами. Ловушки представляли собой шаровидные головки диаметром около 10 μ, на коротких ножках, состоящих из одной или двух клеток. Когда гриб выращивали на агаре, мицелий распространялся главным образом по поверхности этой среды, причем ножки головок стояли вертикально; такое положение было удобно для улавливания нематод.
Когда нематоду подхватывали микропипеткой и подталкивали к одной из головок, она прилипала быстро и прочно, так что через несколько секунд было невозможно оторвать животное, не повредив при этом мицелия.
Было установлено, что не все головки одинаково клейки. По-видимому, у мицелия, как целого, клейкость увеличивается до максимума в определенный период жизни гриба, а затем постепенно исчезает. Клейкость головок оказывала до некоторой степени избирательное действие, потому что некоторые виды нематод к ним не прилипали. Причина этого неизвестна, но структура кутикулы нематоды, несомненно, является важным фактором. У некоторых нематод имеются тонкие полосы, охватывающие их чело и различающиеся по степени жесткости. Головки, по-видимому, приклеиваются только к нематодам, так как при прикосновении таких предметов, как стеклянная микроигла, кусочек рогового внешнего покрова какого-либо насекомого или очень мелкий червяк из семейства земляных червей, прилипания не наблюдалось.
Затем была исследована клейкая сеть гриба Arthrobotrys oligospora. Это, пожалуй, наиболее известный, а также один из наиболее обычных хищных грибов. Его хищнические свойства были известны со времени классического описания, сделанного Цопфом в 1888 г. В этой связи интересно вспомнить, что, когда Цопф описывал сеть, образуемую грибом A. oligospora, он упомянул также о другом грибе, у которого к мицелию были прикреплены на коротких ножках шаровидные образования; он назвал этот гриб Monosporidium repens, полагая, что эти головки являются спорами, но весьма вероятно, что это было не что иное, как гриб Dactylella ellipsospora. Цопф был не единственным исследователем, допустившим подобную ошибку; совсем недавно один гриб с несжимающими кольцами, похожими на кольца гриба Dactylaria Candida, был описан как имеющий споры в виде кольца, которые улавливают нематод, и получил название Annulosporium nematogenum.
Изучая поведение гриба Arthrobotrys oligospora, Командой и де Фонбрюн установили, что прилипающие сети не образуются, когда гриб выращивается в чистой культуре при отсутствии нематод, тогда как внесение в культуру нематод быстро приводит к образованию сетей. Испытание нематоды, удерживаемой в отверстии микропипетки, показало, что сети отличаются клейкостью по всей их поверхности, причем причиной клейкости является клейкая жидкость, выделяемая клетками, образующими петли. Вообще говоря, наблюдения, проведенные над Dactylella ellipsospora, по-видимому, верны и для Arthrobotrys oligospora, у которого также как будто существует оптимальный возраст клейкости; по мере старения мицелия сети становятся все менее эффективными, и, по-видимому, действие их отличается избирательностью, так как они улавливают не все виды нематод. Сети также напоминают клейкие головки в том отношении, что они прилипают только к нематодам, но это верно лишь в том случае, когда сети находятся в нормальном для них влажном состоянии. Если им дать немного высохнуть, например удалить из нормальной влажной окружающей среды, то они приобретают способность прилипать к стеклянной микроигле, и в этих условиях можно было заметить, что сети выделяют клейкое быстро застывающее вещество.
Жизнедеятельность, которая сопровождает выделение клейкой жидкости, можно легко обнаружить, дотронувшись до одной из клеток кончиком микроиглы. Эти клетки, как обычные живые клетки, содержат протоплазму, в которой находятся во взвешенном состоянии многочисленные мельчайшие гранулы; гранулы находятся в состоянии непрерывного движения благодаря непрерывным ударам, наносимым им при движении соседних молекул — хорошо известное броуновское движение, характерное для мелких частиц, находящихся в жидкости во взвешенном состоянии. Когда клетки стимулировали путем прикосновения к ним, гранулы в этом месте начинали двигаться Острее, причем данный эффект распространялся постепенно, до пор, пока все гранулы в клетке не приходили в беспокойное состояние, напоминая рассерженных пчел. В то же время гранулы начинали перемещаться по направлению к той точке стенки клетки, где коснулся кончик микроиглы. Иногда такое же состояние возбуждения наблюдалось в клетках, примыкающих к той, которая испытала прикосновение, что свидетельствует о возможности передачи стимула от одной клетки к другой. Клетки мицелия, расположенные вблизи сети, но не составляющие части последней, также обнаруживают подобную чувствительность.
Связана ли такая возбудимость клеток сети непосредственно с образованием клейкой жидкости, при помощи которой задерживаются нематоды, или образование жидкости не связано с фактом чувствительности клеток к прикосновению, неизвестно. Однако перемещение гранул протоплазмы по направлению к точке прикосновения наводит на мысль о возможности тесной их связи с деятельностью секреции, как называется выделение клеткой веществ, используемых за ее пределами.
Последним объектом опытов был гриб Stylopage hadra. Этот гриб отличается в некоторых отношениях от остальных грибов, улавливающих нематод. Он принадлежит к совершенно иной группе грибов, чем Arthrobotrys и родственные ему грибы, к группе более примитивной, в которой нити, составляющие мицелий, не разделены поперечными перегородками на отдельные клетки. Кроме того, S. hadra не имеет ловушек для нематод как таковых, но вся поверхность мицелия у него клейкая, так что он удерживает каждую нематоду, которая имела несчастье его коснуться.
Было установлено, что S. hadra ведет себя очень похоже на Arthrobotrys oligospora и Dactylella ellipsospora. В развитии мицелия наблюдалась определенная стадия, на которой его клейкость, как и у остальных двух грибов, была наибольшей. Когда до гиф дотрагивались кончиком микроиглы, то сейчас же становилась заметна такая же деятельность протоплазмы, какая наблюдалась у Arthrobotrys oligospora, но так как здесь отсутствовали поперечные перегородки, препятствующие движению веществ вдоль всей гифы, возбуждение легко передавалось на некоторое расстояние в обе стороны от точки стимуляции и при помощи кинематографа было возможно измерить скорость перемещения стимула по живой протоплазме. Было установлено, что состояние повышенной активности может быть вызвано трением микроиглы или просто давлением. В этом случае казалось возможным, что заметное накопление гранулярной протоплазмы вокруг стимулируемой точки было связано с образованием клейкого вещества, при помощи которого удерживается нематода.
Замечательные опыты Командона и де Фонбрюна не оставляли сомнений относительно двух пунктов: во-первых, образование сетей, колец и других ловушек для нематод является результатом реакции гриба на воздействие какого-то вещества, выделяемого самой нематодой, и, во-вторых, сжимающиеся кольца (по меньшей мере) могут быть приведены в действие трением без присутствия нематод. Эти два экспериментатора не продолжили своей работы; их основная задача заключалась в использовании микроманипулятора для изучения некоторых реакций живых клеток на различного рода воздействия, а после проведения намеченных ими опытов с хищными грибами они переключили свое внимание на другие вопросы.
Мы видели, что хищные грибы, как правило, не образуют ловушек для нематод при выращивании в чистой культуре, но образуют их при наличии добычи, однако добавление небольшого количества воды, в которой жили нематоды, стимулирует образование ловушек даже без добавления самих нематод. Этот любопытный факт привлек к себе внимание других французских исследователей. Совершенно ясно, что образование ловушек бывает вызвано каким-то химическим веществом, растворимым в воде, которое образуют нематоды, и диффундирующим из организма животного в окружающую его воду. Очевидно, исследования следует вести в направлении выяснения вопроса, могут ли другие органические вещества, не производимые нематодами, вызвать те же самые результаты; если бы оказалось, что такие вещества существуют, то изучение таких веществ, которые способны вызвать образование ловушек, могло бы дать ключ к определению природы стимулирующего материала, образуемого нематодами в естественных условиях.
С этой целью Е. Рубо и Р. Дешьен испытывали действие животных продуктов, сильно различающихся по своей природе и происхождению, на чистые культуры хищных грибов. Грибы выращивали на агаре в плоских круглых стеклянных тарелках, известных под названием чашек Петри, имевших 10 см в диаметре. Испытываемые растворы добавляли к грибам, выращиваемым в чашках Петри; степень реакции, если последняя имела место, определялась путем подсчета числа ловушек, образовавшихся через определенный промежуток времени. Было обнаружено, что образование ловушек начинается через 24—48 час и достигает максимума обычно через 3—4 дня после добавления стимулирующего вещества.
Имея в виду тот факт, что хищные грибы часто образуют небольшое число ловушек даже и в чистой культуре, было решено, что реакция не будет считаться положительной, если не будет превышено некоторое минимальное число ловушек.
Было обнаружено, что наличие некоторых бактерий может оказать стимулирующее действие на образование ловушек — факт, который следует учесть, так как некоторые из исследованных материалов, таких, как экстракты из экскрементов человека в животных, содержали очень большие количества бактерий. Поэтому было решено, что часть опытов будет проведена на веществах, которые можно получить в стерильном состоянии, для того чтобы их можно было сравнить с другими материалами, в которых присутствовали бактерии. Способностью стимулировать образование ловушек у хищных грибов обладают не одни только нематоды, а еще целый ряд различных органических веществ. Некоторые из полученных реакций представляют особый интерес. Из приведенных данных видно, что как сыворотка, так и экскременты человека обладают большой активностью, тогда как сыворотка и экскременты кролика значительно менее эффективны. Отсюда можно сделать вывод, что наиболее важное значение имеет не тип продукта, а животное, от которого этот продукт получен. Следует отметить, что как вытяжка из Parascaris equorum, так и вытяжка из земляного червя вызвали сильную реакцию. Эти два вида животных — «черви» в общепринятом смысле, но они вовсе не родственны один другому. Parascaris — круглый червь, с зоологической точки зрения близко родственный нематодам, тогда как земляные черви представляют собой сегментированных червей, относящихся к совершенно иному типу представителей животного мира.
В итоге можно сказать, что образование ловушек для нематод представляет собой реакцию, которую можно вызвать путем воздействия целым рядом совершенно различных продуктов животного происхождения. В то время как опыты показывают, что различные вещества сильно различаются по своей способности вызывать реакцию, нет никаких данных, говорящих о том, что с ней связано какое-либо одно определенное вещество.
Все материалы, использованные Рубо и Дешьеном, были животного происхождения. Позже Дешьен и Лами провели дальнейшие опыты с целью выяснения вопроса о том, способны ли продукты растительного происхождения также стимулировать образование ловушек. Эти исследователи испытывали действие различного рода вытяжек из многих растений, но получили определенно отрицательные результаты. По-видимому, эффективны только вещества животного происхождения. Однако было установлено, что наличие некоторых микроорганизмов в чистых культурах Dactylella bembicodes привело к образованию сжимающих колец. Оказалось, что такое же действие производит Euglerta gracillis — крошечный одноклеточный организм, принадлежащий к зеленым жгутиковым — группе, находящейся на границе между животным и растительным миром, так же как Torulopsis pararamosus — микроскопический гриб, напоминающий дрожжи.
Дешьен и Лами исследовали также действие очень небольших количеств сыворотки морских свинок на образование колец у D. bembicodes и установили ее эффективность даже при разбавлении водой до концентрации 1 : 1000. Они утверждают, что действующее вещество не разрушается при нагревании и что обработка спиртом не вызывает снижения его активности.
Обнаружение того обстоятельства, что очень малые количества соответствующего материала оказались эффективными в отношении стимуляции образования ловушек, привело к постановке новых опытов, в которых Лами стремился точнее определить действие как концентрации, так и продолжительности воздействия на интенсивность образования ловушек. Лами испытывал действие вытяжки из земляного червя Lumbricus rubellus как средства, стимулирующего образование сжимающих колец v гриба Dactylella bembicodes. Водная вытяжка из тканей земляного червя применялась в четырех концентрациях: 1/10, 1/100, 1/1000 и 1/10 000, причем в каждом случае сырую вытяжку разбавляли дистиллированной водой. Разбавленными вытяжками обрабатывали чистые культуры гриба двумя различными способами. В одной серии опытов гриб выращивали на агаре; когда культура вполне окрепла, вырезали небольшие квадратики агара с мицелием на его поверхности и помещали в вытяжку, полученную из земляного червя. Таким образом, весь мицелий гриба, использованный для опытов, находился «а одной и той же стадии роста. Для испытания реакции очень молодого мицелия пользовались спорами гриба, которые прорастали и давали начало новым гифам, использованным для проведения наблюдений. Число образовавшихся колец подсчитывали 3 раза через промежутки в 18, 25 и 42 часа после закладки опыта соответственно.
Вытяжка из земляного червя оказывала действие при разведении 1 : 1000, но при разведении 1 : 10 000 раствор оказался слишком слабым для того, чтобы вызвать образование колец. Молодой мицелий, развившийся из прорастающих спор, реагировал быстрее, чем более старые культуры; он давал положительную реакцию уже через 18 час., тогда пак более старому мицелию требовался более продолжительный срок для образования колец. Было также установлено, что образование колец происходило наиболее интенсивно при концентрации 1 часть вытяжки на 100 частей воды; как концентрация 1/10, так и концентрация 1/1000 оказались менее эффективными. Такое указание на возможность существования оптимальной концентрации, при которой вещество становится наиболее эффективным, было одновременно и неожиданным и интересным. Помимо использования в качестве стимулирующего вещества вытяжки из земляного червя, Лами провел дальнейшие опыты с лошадиной сывороткой. Сыворотка представляет собой жидкую часть крови, остающуюся после удаления кровяных телец (красных и белых клеток) и некоторых других составных частей крови при ее свертывании. Для получения сыворотки кровь оставляют стоять до тех пор, пока фибрин (белковое вещество) не загустеет и не захватит при этом тельца, в результате чего можно получить чистую жидкую сыворотку. Лошадиная сыворотка оказалась менее эффективной при сильном разбавлении, чем вытяжка из земляного червя, а потому испытаны были следующие концентрации: неразбавленная, 1/2, 1/10, 1/100 и 1/1000. Опыты проводили по той же схеме, как описано выше, используя как квадратики культуры гриба на агаре, так и молодой мицелий, образовавшийся из спор. Наблюдения проводили через 18, 25 и 40 час. после начала опыта.
Результаты, полученные для лошадиной сыворотки, сходны с теми, которые были получены для вытяжки из земляного червя. Существование оптимальной концентрации здесь даже заметнее, потому что лошадиная сыворотка не дала никаких результатов при использовании в чистом виде и опять оказалась неэффективной в концентрации 1 часть на 1000; наибольший эффект был получен при концентрации 1 часть на 10. Подобно виски, ее следует принимать с небольшим количеством воды, но не разбавляя до затопления. Результаты, полученные для лошадиной сыворотки, также очень ясно показывают, что молодой мицелий более чувствителен к стимуляции, чем старый, потому что молодые гифы, образуемые прорастающими спорами, реагировали значительно быстрее более старого мицелия на кусочках агара.
В результате этих опытов Лами пришел к некоторым общим выводам относительно реакции гриба на вытяжку из земляных червей и на лошадиную сыворотку.
1. Интенсивность реакции зависит от концентрации стимулирующего вещества.
2. Существует минимальная концентрация, которую можно назвать нижним порогом, ниже которого стимулирующее вещество перестает действовать. Для лошадиной сыворотки он равен примерно 1/100, тогда как для вытяжки из земляных червей — 1/1 000.
3. Для лошадиной сыворотки (по меньшей мере) существует также и верхний порог. Растворы более высокой концентрации неэффективны.
4. Между верхним и нижним порогами существует оптимальная концентрация, при которой стимулирующее вещество оказывает наиболее сильное действие; для лошадиной сыворотки такая концентрация равна приблизительно 1/10, а для вытяжки из земляных червей — 1/100.
5. Молодой мицелий, образуемый прорастающими спорами, реагирует быстрее старого, образовавшегося в культуре на агаре.
Опыты, проведенные французскими учеными, сильно пополнили наши сведения относительно материалов, обладающих способностью стимулировать образование хищными грибами ловушек. Совершенно ясно, что это стимул химического характера, что в естественных условиях он должен действовать через какое-то вещество, выделяемое нематодами в процессе их нормальной жизни, и что это гипотетическое вещество должно обладать способностью растворяться в воде и распространяться от нематод к грибам. Однако мы еще не выяснили наиболее важный факт — что это за вещество? Лошадиная сыворотка оказалась эффективным стимулятором, но она представляет собой сложную смесь множества различных веществ, из которых любое может оказаться фактическим стимулятором. В настоящее время необходимо проведение ряда опытов с отдельными веществами, содержащимися в сыворотке, до тех пор, пока не будет обнаружено вещество, столь же эффективное, как сама сыворотка, если исследователю повезет и он будет достаточно долговечен. Эта задача требует длительных и трудоемких исследований.