Если взвесь микробов поместить в тонкую, запаянную с двух сторон стеклянную трубочку, которую погрузить затем в кипящую воду или вообще в среду, нагретую до достаточно высокой температуры, то микроорганизмы погибнут. Однако уничтожение микробов не происходит мгновенно. Для того чтобы уничтожить микробы при данной температуре стерилизации, необходимо определенное время. Это время называют смертельным, или летальным.
Смертельное время при данной температуре можно, например, определить, погрузив в нагретую до данной температуры среду несколько таких тонких, желательно капиллярных, трубочек с микробами. Трубочки должны быть как можно тоньше, чтобы можно было пренебречь временем, требуемым для прогрева содержимого до температуры стерилизации насквозь, и вести, следовательно, отсчет этого времени с момента погружения капилляров в греющую среду. Вынимая через определенные промежутки времени (например, через каждые 5 мин) по одной или несколько трубочек из нагретой среды и мгновенно охлаждая их в ледяной воде (чтобы сразу прекратить действие высокой температуры и считать, что данная трубочка подвергалась нагреву именно заданный промежуток времени), производят микробиологический анализ, позволяющий установить момент, когда в очередной трубочке не окажется живых спор. Время от момента погружения капилляров в нагретую до данной температуры среду до момента, при котором все микробы оказываются уничтоженными, и есть смертельное время при данной температуре.
Нужно сказать, что понятие о смертельном времени является условным и может быть использовано лишь в первом приближении, для удобства обсуждения представлений о процессе гибели микроорганизмов. Позже будет показано, что полностью уничтожить все споры микроорганизмов при тепловой обработке во влажной среде невозможно. Как бы долго ни стерилизовать капилляры с взвесью микробов, количество их будет становиться все меньше и меньше, но всегда некоторая доля их будет оставаться в живых. Тот факт, что через какой-то промежуток времени тепловой стерилизации мы в очередной пробе не обнаружили жизнеспособных спор, говорит лишь о том, что количество микроорганизмов понизилось до уровня, который является меньшим, чем одна спора на трубочку, и, следовательно, если бы для опыта было взято больше капилляров, то спустя промежуток времени, который в предыдущем опыте мы сочли смертельным, мы бы еще обнаружили живые клетки.
Переходя теперь к вопросу о времени, которое необходимо для стерилизации консервов, можно сказать, что если бы при погружении банок в стерилизационный аппарат требуемая температура стерилизации создавалась сразу и одновременно во всей массе продукта (подобно тому, как это практически происходило в тонкой стеклянной трубочке, содержащей взвесь микробов), то установленное капиллярным методом смертельное время при данной температуре и было бы требуемым общим временем стерилизации для консервной банки.
Однако при стерилизации банок паром или горячей водой заданная температура устанавливается не сразу и не одновременно во всей массе продукта. Передача теплоты от теплоносителя к продукту идет от периферии банки к ее центру. Сначала прогреваются слои консерва, находящиеся у поверхности банки, затем теплота проникает постепенно в глубину продукта и. наконец, достигает наиболее отдаленного от периферии места, находящегося вблизи геометрического центра банки.
Таким образом, центральная часть консервной банки, которая считается обсемененной микробами в такой же мере, как и другие участки, начинает стерилизоваться при заданной температуре значительно позже, чем периферийные слои. Следовательно, именно эта центральная часть является наиболее неблагополучной с точки зрения возможности выживания в ней микробов.
Поэтому, говоря о смертельном времени для микроорганизмов, имеют в виду клетки, находящиеся в центральной части банки, а, значит, отсчет этого времени нужно вести с момента достижения заданной температуры стерилизации в центре банки, а не от начала прогрева банки в стерилизационном аппарате.
Тогда в первом приближении общее время стерилизации τобщ будет состоять из двух отрезков: времени проникновения теплоты в центр банки (имея в виду достижение в центре банки температуры стерилизации) τпр и смертельного времени τсм, т. е. времени, которое требуется для уничтожения микроорганизмов, находящихся в центре банки, начиная с того момента, когда в центре банки достигнута заданная температура: τобщ = τпр + τсм.
Необходимо оговориться, что такой подсчет времени стерилизации в значительной мере неправилен, так как микроорганизмы, находящиеся в центре банки, начинают погибать не в тот момент, когда в центре достигнута именно заданная температура стерилизации, а несколько раньше, когда центр прогрет до температурного уровня, пусть меньшего, чем заданная температура стерилизации, но все равно смертельного для микробов. Поэтому τобщ не равно сумме τпр и τсм, а меньше этой суммы. Правильнее всего сказать, что общее время стерилизации является функцией от времени прогрева и смертельного времени, т. е. τобщ = f(τпр, τсм).
Итак, для того, чтобы уяснить факторы, от которых зависит общее время стерилизации, нужно рассмотреть в отдельности факторы, определяющие смертельное время (микробиологическую составляющую), и факторы, определяющие время проникновения теплоты в центр банки (теплофизическую составляющую).
Факторы, влияющие на смертельное время (микробиологическая составляющая)
Смертельное время зависит от следующих факторов: температуры стерилизации; химического состава консервов; вида микроорганизмов и их количества.
Температура стерилизации. Как нельзя говорить о смертельном времени, не учитывая температуру стерилизации, так нельзя говорить и о температуре, не связывая ее со временем, необходимым для такой обработки. Какой-то определенной температуры, являющейся смертельной для данного вида микроорганизмов. не существует. Микроорганизмы можно уничтожить при разных температурах, начиная приблизительно с 60°С. Вопрос сводится лишь к времени, которое требуется для уничтожения микробов при данной температуре. Таким образом, смертельные условия для данного вида микроорганизмов нельзя определить одной лишь температурой, а только сочетанием «смертельная температура — время».
Естественно, что зависимость между смертельным временем и температурой обратная, т. е. с повышением температуры стерилизации смертельное время снижается. При этом оказывается, что с повышением температуры смертельное время не просто снижается, а снижается в сильнейшей мере. Так, по данным Эсти и Мейера, отмирание спор С. botulinum характеризуется следующими параметрами:
| Температура, °С | 100 | 105 | 110 | 115 | 120 |
| Время, мин | 330 | 100 | 32 | 10 | 4 |
Из приведенных данных видно, что относительно небольшое повышение температуры стерилизации приводит к резкому сокращению смертельного времени. Или, в математической форме, повышение температуры стерилизации в арифметической прогрессии приводит к сокращению смертельного времени в геометрической прогрессии.
Бигелоу обратил внимание на то, что если кривые смертельного времени построить в полулогарифметических координатах, отложив на горизонтальной оси температуру в линейных отрезках, а на вертикальной — логарифмы значений смертельного времени, то кривые эти выпрямляются. Способность кривых смертельного времени выпрямляться при построении их в полулогарифмических координатах дает возможность характеризовать их простыми аналитическими выражениями.
Стерилизацию можно проводить при разных температурах, меняться будет лишь продолжительность процесса. В связи с этим возникает вопрос, что лучше: дольше стерилизовать при умеренных температурах, или же стерилизовать быстро при высоких температурах?
Для ответа на этот вопрос необходимо принять во внимание соображения, относящиеся к качеству стерилизованной продукции и к характеристике процесса стерилизации с количественной стороны.
Еще недавно считалось, что тепловая обработка пищевых продуктов при высоких температурах вызывает ряд нежелательных изменений их качества, прежде всего органолептических свойств, поэтому технологические процессы (сушку, варку, стерилизацию) следует проводить при умеренных температурных условиях.
Об ухудшении качества судили по гидролитическим реакциям, которые приводят к размягчению пищевых продуктов. В определенной мере они необходимы, однако их следует поддерживать в определенных границах, иначе продукты получаются разваренными.
Другой тип нежелательных изменений связывают с так называемыми меланоидиновыми реакциями, протекающими между редуцирующими сахарами и свободными аминокислотами. В результате образуются сахаропротеиновые комплексные темноокрашенные соединения, придающие пищевым продуктам нежелательные «уваренные» тона, посторонние привкусы, запахи и т. п.
Однако по мере накопления информации становилось ясно, что глубину упомянутых реакций нельзя связывать только лишь с одним фактором — температурным уровнем процесса, а следует учитывать два фактора: температуру и продолжительность выдержки продукта при этой температуре.
Оказалось, что для ограничения и подавления сахароаминных реакций следует найти оптимальное сочетание этой пары «температура — время».
Возьмем для примера процесс потемнения пищевых продуктов при тепловой обработке, приняв в качестве критерия интенсивность протекающих деградационных реакций ухудшения окраски. Исследования показали, что скорость реакций деградации растет с повышением температуры, однако время, необходимое для достижения стерильности пищевых продуктов, с повышением температуры уменьшается в неизмеримо большей степени. Иначе говоря, повышая температуру стерилизации, мы доживаемся уничтожения возбудителей порчи задолго до того, как реакции деградации пищевых веществ приобретут существенное значение для качества.
Сказанное четко иллюстрируется кривой на рисунке. По вертикальной оси отложена степень потемнения в условных единицах, причем степень потемнения при 110 °С принята за 100 единиц, по горизонтальной оси — температура стерилизации.
Степень потемнения продукта при различных режимах стерилизации
Как следует из этого рисунка, с повышением температуры стерилизации степень потемнения резко уменьшается. Так, при 120°С степень потемнения составляет всего 30% от окраски при 110°С, а при 140°С — всего 2%. Следует только иметь в виду, что отложенные на кривой точки не означают равную продолжительность выдержки при указанных температурах, а являются лишь изосмертельными т. е. характеризуют такое сочетание смертельных факторов (температура — время), при котором степень уничтожения микроорганизмов одинакова. Например, для достижения смертельного эффекта при 120 °С требовалась 10-минутная выдержка при этой температуре, а при 140 °С тот же стерилизационный эффект достигался всего за 8 с!
Таким образом, для замедления химических реакций, вызывающих ухудшение качества стерилизованной продукции, следует вести тепловую обработку при возможно более высоких температурах в течение очень короткого промежутка времени. В литературе этот принцип принято именовать высокотемпературной кратковременной стерилизацией («ВТ—КВ»).
Итак, вопрос о выборе температуры стерилизации с позиций качества продукции ясен. Рассмотрим теперь влияние температуры стерилизации на количественную характеристику процесса.
С одной стороны, казалось бы, применение высокотемпературных кратковременных режимов стерилизации следует лишь приветствовать, ибо помимо улучшения качества продукции при этом резко сокращается продолжительность обработки и, следовательно, во много раз увеличивается пропускная способность стерилизационной аппаратуры.
Однако на деле проблема использования высокотемпературных кратковременных режимов оказывается весьма сложной, стоит только представить себе протекание процесса тепловой обработки консервных банок в современных стерилизационных аппаратах.
Допустим, мы задались целью простерилизовать консервы в автоклавах при температуре 140°С, имея в виду, что содержимое банки должно быть прогрето для этой температуры на всю глубину. Не говоря уже о том, что в техническом отношении невозможно в течение всего лишь нескольких секунд прогреть автоклав до 140°С, но, самое главное, невозможно очень быстро прогреть на всю глубину содержимое консервной банки. Чтобы «добраться» температурой 140°С до центра банки требуется по крайней мере несколько минут, а это с позиций качества продукции совершенно недопустимо. Как отмечалось, температура 140°С оказывает благоприятное влияние на качество только в том случае, если она поддерживалась лишь в течение нескольких секунд. К тому же, когда температура 140°С достигла глубины продукта и уничтожила находящуюся там микрофлору, «убрать» ее за несколько секунд при охлаждении консервов в автоклаве после стерилизации также невозможно. Получается, что стерилизация консервов при 140°С в автоклавах по чисто техническим причинам не может быть осуществлена быстро, за несколько секунд, а должна измеряться многими минутами, что неминуемо приведет к резкому ухудшению качества продукции.
Вот почему новый технологический процесс — высокотемпературная кратковременная стерилизация — не может быть реализован в обычных стерилизационных аппаратах, а требует специального аппаратурного оформления.
Применяемые для этой цели установки основаны на принципе стерилизации продукта в тонком слое. Продукт стерилизуется при повышенных температурах тем или иным способом до фасовки в тару, затем в стерильных условиях охлаждается и фасуется в стерильно подготовленную тару, которая вслед затем герметизируется в стерильных условиях. Подготовленный таким способом продукт уже не нуждается в дальнейшей тепловой обработке. Такой способ сохранения пищевых продуктов называют асептическим консервированием.
Следует также иметь в виду одно обстоятельство, которое ограничивает снижение времени стерилизации за счет повышения температуры — это сохранность ферментов. Исследования показали, что при обычной стерилизации, которая продолжается при умеренных температурах довольно долго, сначала инактивируются ферменты, а затем уже погибают микроорганизмы. Поэтому процесс обычной стерилизации «настраивают» по микробам, справедливо полагая, что к тому времени, когда микроорганизмы будут уничтожены, ферменты и подавно окажутся инактивированными.
При высокотемпературной же кратковременной стерилизации ферменты оказываются более термоустойчивыми, чем микроорганизмы. Поэтому может быть такой случай, когда уничтожение микробов при данном режиме стерилизации будет обеспечено, ферменты же из-за резко сокращенного времени тепловой обработки останутся не инактивированными. Несмотря на стерильность, такие консервы не будут стойкими при хранении и могут подвергнуться ферментативной порче.
Химический состав консервов. На смертельное время оказывает влияние не только температура стерилизации, но и химический состав среды, в которой находятся данные микробы.
Выше было отмечено влияние кислотности среды на развитие микроорганизмов. Причем из всех факторов внешней среды, которые влияют на термоустойчивость микробов, концентрация водородных ионов в нагреваемой среде является самым главным.
Различными исследователями было установлено, что максимальная термоустойчивость спорообразующих бактерий проявляется в нейтральной области при pH 6—7, быстро снижаясь при отклонениях в ту и другую стороны. Нужно, однако, сказать, что, несмотря на справедливость общего правила обратной зависимости между активной кислотностью среды и смертельным временем, в целом оно оказывается верным не при всех диапазонах pH. Так, Эсти и Мейер установили, что при pH выше 5,0 какой-то еще фактор, кроме концентрации водородных ионов, оказывает сильнейшее влияние на смертельное время.
Ланг, изучая режимы стерилизации рыбных продуктов, не нашел определенной зависимости между pH и смертельным временем для спор С. botulinum в интервале pH 5,2—6,8, а при pH 4,9 наблюдалось заметное снижение термоустойчивости.
По данным А. Рогачевой, значительное влияние на термоустойчивость оказывает не только активная кислотность среды, но и природа самой кислоты. Так, наиболее обеспложивающим действием при одном и том же pH обладает молочная кислота, затем яблочная. Несколько слабее действуют на бактерии уксусная и лимонная кислоты.
Из других элементов химического состава консервов наибольшее влияние на смертельное время оказывают антибиотические вещества растительного происхождения — фитонциды. Работами А. Рогачевой и сотр. установлено, что время, необходимое для тепловой стерилизации консервов, снижается при добавлении в эти консервы таких богатых фитонцидами овощей или растений, как лук, томаты, перец, чеснок, морковь и белые корнеплоды, ревень, сухие пряности и горчица. В ряде случаев оказывается более эффективным добавлять не растения, а приготовленные из них концентраты фитонцидов. Например, вместо того, чтобы добавлять томатный соус, можно вносить в пищевой продукт фитонцидный концентрат томатов называемый томатином или ликоперсицином, а вместо горчицы — действующее начало этого растения — эфирное аллилгорчичное масло СН2 = СН—CH2 = CNS. По данным А. Рогачевой добавление аллилового масла в количестве нескольких миллионных долей (т. е. нескольких десятитысячных процента) к маринадам позволяет не только снизить продолжительность стерилизации этих консервов, но и вовсе обойтись без тепловой обработки. Об этом же говорят исследования А. С. Зверьковой и И. Г. Нестерюк, которые показали резкое повышение микробиологической стабильности виноградного сока при хранении его в танках на холоде при добавлении всего 0,0001% аллилгорчичного масла.
Весьма значительное влияние на смертельное время оказывают жиры, однако в отличие от кислот и фитонцидов они не понижают, а повышают термоустойчивость микроорганизмов. Защитное действие жиров объясняется с позиций физико-химических превращений, происходящих на границе двух различных гетерогенных жидкостей: белковый коллоидный раствор (микробная клетка) — жир. Как известно, при соприкосновении гидрофильных коллоидов (белков, сапонинов, мыл и т. п.) с жиром на границе двух фаз почти мгновенно образуется своего рода коагуляционная пленка, изолирующая эти фазы одну от другой. Если капелька жира попадает в водный белковый раствор, она сразу окружается белковой пленкой. Если капелька белкового коллоидного раствора попадает в жир, эта капелька тоже сразу будет окружена плотным межфазным чехлом. Эти межфазные чехлы представляют собой полярные молекулы, которые строго ориентируются на поверхности двух фаз, направляясь в данном случае одна к другой своими гидрофобными концами.
Наличие плотного гидрофобного чехла вокруг бактериальной клетки препятствует проникновению к ней влаги и затрудняет тем самым коагуляцию белков, являющуюся, как известно, гидратационной реакцией. Термическая обработка микробной клетки в таких условиях напоминает воздействие «сухого жара», к которому микроорганизмы более устойчивы, чем к «влажному». Поэтому консервы, содержащие жиры (например, рыбные консервы в масле, «Свинина тушеная» и т. п.), нужно стерилизовать дольше, чем консервы, не содержащие жира.
Определенное влияние на смертельное время оказывают сахар и сахарные сиропы. Ученые обратили внимание на то, что сахар оказывает защитное влияние на микробы при нагревании среды. Так, Петерсон, Левин и Буханан нашли, что дрожжи легче погибают при 100°С в дистиллированной воде, чем в сиропе. Смертельное же время в сиропе концентрацией 24% оказалось гораздо меньше, чем в сиропе, концентрация которого составляла 36% (соответственно 6 и 28 мин). Баумгартнер и Уоллес обнаружили, что смертельное время для микроба Escherichia coli при 70°С в воде составило 4 мин, а в 30%-ном сахарном сиропе 30 мин. По-видимому защитное действие сахара на микроорганизмы объясняется тем, что в сахарных сиропах происходит осмотическое отсасывание влаги из микробных клеток и что именно пониженное содержание влаги делает микробную клетку устойчивой к нагреванию.
Небольшие концентрации соли в пищевых продуктах влияют на микроорганизмы при нагревании защитным образом, в то время как повышенное содержание соли способствует быстрейшему уничтожению микроорганизмов. Так, Вильжуан приводит следующие данные о выживаемости микроорганизмов в рассоле консервов «Зеленый горошек» при 115°С:
| Концентрация соли, % | 0 | 0,5 | 1,0 | 1,5 | 2,0 | 2,5 | 3,0 | 4,0 |
| Выживаемость микроорганизмов, % | 15,0 | 37,8 | 86,7 | 73,3 | 75,6 | 78,9 | 40,0 | 13,3 |
Из этих данных видно, что соль оказала защитное действие в концентрации до 2,5% включительно, после чего последовало резкое снижение термоустойчивости. Эсти и Мейер отметили, что 1—2%-ные концентрации соли увеличивают термоустойчивость С. botulinum, но при содержании соли свыше 8% смертельное время снижается. Можно предположить, что в небольших концентрациях соль осмотически отсасывает влагу из микробной клетки, как это происходит и в сахарных сиропах, и тем повышает ее устойчивость к нагреванию. При повышенных же концентрациях соли начинает проявляться электролитическое высаливающее действие хлорида натрия, в результате чего склонность белков протоплазмы к коагуляции возрастает и смертельное время уменьшается.
Вид микроорганизмов и их количество. Смертельное время в сильнейшей мере зависит от характера микрофлоры, могущей развиваться в данном пищевом продукте, так как способность переносить высокие температуры у разных микробов неодинакова, а вегетативные клетки бактерий погибают гораздо быстрее, чем споры.
Некоторые ученые объясняют это тем, что споры бактерий содержат мало воды, а в таких условиях затрудняется процесс коагуляции белков, вызывающий смерть бактериальной клетки при нагревании. Другие исследователи показали, что общее содержание влаги как в вегетативной клетке, так и в споре примерно одинаково. Поэтому, говоря о малом содержании влаги в спорах, следует иметь в виду не общую, а свободную влагу. Все дело в том, что большая часть влаги в споре находится в связанном состоянии и, следовательно, не может принять участие в коагуляции клеточных протеинов. Кроме того, устойчивость спор к нагреванию объясняется наличием у них плотной водонепроницаемой оболочки, не пропускающей окружающую влагу внутрь споры. Вот почему смертельное время для большинства бесспоровых бактерий, т. е. для вегетативных клеток, составляет всего несколько минут при температуре 60—80°С. Наибольшее смертельное время обнаружено у В. coli — 15 мин при 80 °С.
Гораздо длительнее смертельное время для спорообразующих микробов, т. е. их спор. Так, по данным А. Рогачевой, смертельное время при 100°С составляет (в мин) для спор:
- В. subtilis — 120
- В. Mesentericus — 110
- В. botulinum (штамм В) — 150
- В botulinum (штамм А) — 300
Бигелоу и Эсти заметили, что некоторые термофильные микроорганизмы выдерживают непрерывное кипячение в кукурузном соке при pH 6,1 в течение 24 ч. Донк сообщил, что смертельное время для одного из плоскокислых термофилов при pH 6,1 и температуре 120°С составляет 11 мин, а Вильямс, Мерилл и Камерон нашли, что смертельное время для одного из микробов, относящихся к этой же группе, составляет при 120°С в буферной среде (pH 6,95) 35 мин.
Большое влияние на смертельное время оказывает и количество микроорганизмов. Для примера рассмотрим данные одного исследования, приведенные в таблице.
| № культуры | Число cпop на 1 см2 | Время, требуемое для умножения спор при 115 °С, мин |
| 26 | 46000 | 65 |
| 4300 | 35 | |
| 400 | 28 | |
| 40 | 22 | |
| 4019 | 35000 | 42 |
| 2550 | 26 | |
| 278 | 21 | |
| 58 | 10 | |
| 4112 | 35000 | 50 |
| 1000 | 28 | |
| 100 | 18 | |
| 13 | 10 |
Если обратиться, например, к культуре № 26, то получается, что при уменьшении начального содержания микроорганизмов с 46000 до 40 спор, т. е. примерное 1000 раз, смертельное время сокращается почти в 3 раза.
На первый взгляд может показаться странным, что чем больше микроорганизмов находится в определенном объеме стерилизуемого продукта, тем больше времени требуется для их уничтожения. Однако это объясняется закономерностями кинетики отмирания микробных клеток при повышенных температурах. Изучая гибель микроорганизмов под влиянием нагрева, исследователи пришли к убеждению, что с физико-химической стороны процессы, вызывающие смерть микробной клетки, представляют собой мономолекулярную реакцию коагуляции белков протоплазмы и что, следовательно, скорость уничтожения микробов поддается математическому анализу, справедливому для реакции первого порядка.
Учитывая логарифмический характер гибели микроорганизмов при нагревании, полностью уничтожить их при стерилизации невозможно. Никогда число микроорганизмов путем тепловой стерилизации (в пределах существующей техники проведения этого процесса, т. е. при нагревании во влажной среде) нельзя свести к нулю. Можно только всячески уменьшать количество спор при нагревании, доводя их до одной на 1000, на 10 тыс., на 1 млн. банок и т. д., но не уничтожая на 100%. Следовательно, можно говорить не об абсолютной стерильности, а только о какой-то степени стерильности n, определяемой логарифмом.
Физический смысл этой величины легче уяснить, если рассмотреть логарифм обратной величины приняв определение, что степенью стерильности n называется логарифм доли выживших микроорганизмов, взятый с обратным знаком.
Таким образом, точно так же, как нельзя говорить о полной стерильности, нельзя говорить и о смертельном времени в абсолютном понимании, т. е. как о времени полного уничтожения микроорганизмов. Смертельным временем можно лишь назвать время, требующееся для достижения какой-то степени стерильности (более или менее высокой), т. е. для доведения первоначального количества микроорганизмов до какого-то заранее установленного и, конечно, очень низкого уровня.
Источник: Б.Л. Флауменбаум, С.С. Танчев, М.А. Гришин. Основы консервирования пищевых продуктов. Агропромиздат. Москва. 1986