Прежде чем перейти к характеристике белков, из которых построена клейковина, рассмотрим вкратце вопрос о присутствии в ней таких веществ белковой природы, которые не могут считаться ее компонентами, но подобно небелковым веществам образуют лишь трудноотделимые примеси. Речь идет о ферментах. Последние, как известно, растворимы в воде, однако при отмывании клейковины их не удается удалить полностью вследствие высокой сорбционной способности клейковикных белков.
Еще в 1889 году Рейхлер (цит. по Baker, Hulton, 1908) наблюдал, что если клейковину обработать разбавленной кислотой, то получается раствор, обладающий после нейтрализации диастатической активностью. Эти опыты были продолжены Бэкером и Гультоном (Baker, Hulion, 1908), показавшими, кроме того, что глиадиновая фракция клейковины не содержит диастаза, который связан, по-видимому, с глютенином. С другой стороны, хорошо известно, что если свежеотмытую сырую клейковину оставить на некоторое время в воде при комнатной температуре, то она постепенно становится более мягкой и растяжимой, т. е. изменяется в том же направлении, как и под действием добавленных извне протеолитических ферментов. По-видимому, при этом происходит постепенное дезагрегирование клейковины протеолитическими ферментами зерна, которые сорбируются белковым субстратом и не могут быть полностью удалены при обычном отмывании клейковины.
В 1941 г. Н. И. Проскуряков и А. А. Бундель провели специальные опыты по количественному определению активности протеолитических ферментов в сырой клейковине. Клейковину диспергировали в слабой молочной кислоте (0,005 п) и смесь оставляли на 24 часа при 30° в присутствии толуола, после чего определяли количество азотистых веществ, неосаждаемых 2%-ной трихлоруксусной кислотой. Контролем служила молочнокислая дисперсия клейковины, осаждаемая трихлоруксусной кислотой немедленно после ее приготовления (без автолиза). Оказалось, что в результате автолиза происходило заметное накопление продуктов дезагрегирования клейковины, неосаждаемых трихлоруксусной кислотой, причем количество этих веществ возрастало в 1,5 раза, если к реактивной смеси добавляли цистеин.
В другой серии опытов те же авторы наблюдали увеличение водорастворимого азота при автолизе сухой клейковины в буферной смеси при рН 4,7 и 7,0.
Позднее Гаррис и Фрокджер (Harris, Frokjer, 1952) разделили сырую клейковину мягких и твердых пшениц на 3 фракции путем осаждения их из дисперсий в разбавленной молочной кислоте (0,013 п) возрастающими количествами насыщенного раствора Са(ОН)2 (добавляемого до рН 5,0; 5,0—5,5 и 5,5—7,0) и показали, что каждая из полученных фракций обладала протеолитической активностью, определяемой по приросту небелкового азота после автолиза в 0,15 п уксусной кислоте.
В недавнее время Н. И. Проскуряков и Е. С. Хромова (1955) исследовали ферментативную активность четырех образцов сухой клейковины, обезвоженной: 1) в вакуум-эксикаторе, 2) многократной обработкой ацетоном, 3) лиофилизацией и 4) лиофилизацией после очистки путем двукратного растворения сырой клейковины в 0,05 п уксусной кислоте и осаждения ацетатом натрия.
Активность ферментов в клейковине зависит от способа ее очистки и обезвоживания, что вполне понятно, так как различная подготовка препаратов может, во-первых, удалить часть первоначально сорбированных ферментов, а, во-вторых, изменить прочность сорбционной связи между клейковиной и ферментами. Например, по данным тех же авторов, амилазная активность клейковины повышается на 20% после обработки клейковины бутиловым спиртом, так как это способствует лучшему переходу амилазы в растворимое состояние.
В литературе имеются некоторые сведения о характере протеолитических ферментов, содержащихся в клейковине. Так как протеиназу пшеничной муки относят обычно к ферментам типа папаина (Jorgensen, 1935, 1936; Balls, Hale, 1936, 1938; Проскуряков, 1938; Проскуряков и Бундель, 1938; Hale, 1939; Кретович, 1948), то естественно предположить, что и в отмытой клейковине содержится тот же энзим, тем более, что в упомянутых выше опытах Н. И. Проскурякова и А. А. Бундель (1941) наблюдалось активирующее действие цистеина на автолиз клейковины, диспергированной в молочной кислоте. Фактически, однако, в клейковине, наряду с протеиназой папаинового типа, присутствует, по-видимому, и другой протеолитический фермент, обнаруженный впервые Олькотом. Сапититейном и Блишем (Olcott, Sapirstein, Blish, 1943; Olcott, 1950) и названный ими «клейковинной протеиназой» (gluten proteinase).
Действие этого фермента обнаруживается по падению вязкости хранящихся растворов сырой клейковины в 0,1 п уксусной кислоте, причем одновременно увеличивается количество аминного азота и азота, неосаждаемого трихлоруксусной кислотой. Если дисперсию клейковины в уксусной кислоте прогреть в течение 5—10 минут при температуре около 100°, то в дальнейшем она хранится без всяких изменений. При таком нагревании происходит разрушение энзима, тогда как сама клейковина не денатурируется, что доказано рядом опытов. Достаточно упомянуть, что путем высаливания из прогретой дисперсии, как и из контрольной, можно вновь выделить исходную сырую клейковину совершенно нормального качества. Все попытки получить клейковину, свободную от «клейковинной протеиназы», не увенчались успехом, несмотря на тщательное отмывание в воде и солевых растворах, переосаждение из уксусной кислоты и т. п.
Путем фракционирования клейковины показано, что энзим связан в большей степени с глютенином, нежели с глиадином. «Клейковинная протеиназа» отличается от обычной протеиназы муки папаинового типа своей нерастворимостью в воде и солевых растворах, оптимумом рН (около 2—4) и особенно способностью обратимо инактивироваться салицнлатом натрия, который, как известно (Соседов, Вакар, Дроздова, 1940), не тормозит работу папаина и папаиназы пшеницы. Действие восстановителей на клейковину, диспергированную в растворе салицилата натрия, где «клейковинная протеиназа» заведомо инактивирована, резко снизило вязкость без заметного увеличения количества аминного азота. Авторы предполагают, что в этом случае происходило активирование ферментов папаинового типа, присутствующих в клейковине наряду со специфической «клейковинной протеиназой». Дальнейшие работы прольют, вероятно, свет на природу и особенности этого фермента.
Все изложенное убедительно показывает, что клейковина, независимо от тщательности ее отмывания и очистки, всегда обладает некоторой ферментативной активностью. Выше отмечалось, что причиной этого является сорбция различных ферментов зерна белками клейковины. Исследования последних лет заставляют, однако, считаться и с другой возможной причиной ферментативной активности клейковины. Со времени Осборна считалось, что запасные белки растений представляют собой инертный материал, не принимающий активного участия в обмене веществ. Новейшие исследования показали ошибочность этой точки зрения. Так, в работе А. А. Бундель, М. П. Знаменской и В. Л. Кретовича (1952) приведены примеры активного участия запасных белков пшеницы (глиадин), гороха (легумин) и сои (глиценин) в ферментативном переносе аммиака на пировиноградную кислоту с образованием аланина. Дальнейшие исследования В. Л. Кретовича, А. А. Бундель, С. С. Мелик-Саркисяна и К. М. Степанович (1954) показали, что если при выделении белковых препаратов из семян различных растений избегать применения органических растворителей и высоких температур, денатурирующих белки, проводить все операции при низких температурах и обезвоживать белки лиофилизацией, то получаются препараты со свойствами нативных белков. В отличие от препаратов, выделенных по методам Осборна, белки, полученные «мягкими» методами из семян гороха — легумелин, легумин и вицилин, обладали ясно выраженной ферментативной активностью: каталазной, пероксидазной, инвертазной, карбоксилазной и дипептидазной. Авторы считают, что эта активность не является следствием сорбции ферментов на белковых препаратах, но присуща самому белку, если он не денатурирован и находится в состоянии, близком к нативному. Запасным белкам семян принадлежит важнейшая роль в обмене веществ прорастающего зародыша и возможно, что источником новообразования ферментов при прорастании служат компоненты запасных белков с теми или иными каталитическими функциями.
В дальнейших работах В. JI. Кретовича и сотрудников (Кретович, Бундель, Лепина и Мелик-Саркисян, 1956; Кретович и Смирнова, 1957) было показано, что запасные белки семян и других растений также проявляют ферментативную активность, величина которой зависит в значительной мере от окислительно-восстановительных условий. Например, альбумин, выделенный из семян тыквы, представлял собой поликомпонентную белковую систему, состоящую из ряда белков, обладающих дегидразной, уреазной, амилазной и дипептидазной активностями. Альбуминный комплекс пшеничной муки был разделен Н. И. Проскуряковым и Е. С. Хромовой (1956) на фракции, проявлявшие амилазную, полифенолоксидазную и фитазиую активности. Водорастворимые белки пшеничного зародыша, поданным Н. И. Проскурякова и И. В. Родионовой (1960), также состоят из нескольких компонентов с амилазной, инвертазной, каталазной, пероксидазной, фитазной, дезоксири — бонуклеазной и цистинредуктазной активностями.
Все эти данные были получены в результате выделения, очистки и фракционирования запасных белков семян современными методами, обеспечивающими минимальную денатурацию белковых веществ с целью исследования их в состоянии, наиболее близком к нативному. Высокая степень очистки белковых препаратов и их фракций позволяет предполагать, что каталитическая активность, обнаруживаемая в описанных опытах, присуща самим запасным белкам, однако это нельзя считать доказанным и остается весьма вероятным, что белковые препараты содержат ферменты в виде примесей. Клейковину нельзя получить в столь очищенном состоянии, как другие запасные белки, особенно способные кристаллизоваться, и потому в опытах с клейковиной опасность «загрязнения» ее препаратов ферментами возрастает во много раз. Вследствие этого нам кажется, что ферментативную активность, проявляемую клейковиной, следует объяснить прежде всего присутствием в ней сорбированных ферментов, тогда как собственная каталитическая активность белков клейковины, хотя и возможная принципиально, в настоящее время еще не обоснована экспериментально.