Форма белковой молекулы. Исследования нативной конформации белковых молекул показали, что эти частицы в большинстве случаев имеют более или менее асимметричную форму. В зависимости от степени асимметрии, т. е. соотношения между длинной (b) и короткой (а) осями белковой молекулы различают глобулярные (шаровидные) и фибриллярные (нитевидные) белки.
Глобулярными являются белковые молекулы, у которых свертывание полипептидных цепочек привело к образованию сферической структуры. Среди них встречаются строго шаровидные, эллипсовидные и палочкообразные. Они различаются по степени асимметрии. Например, яичный альбумин имеет b/а = 3, глиадин пшеницы — 11, а зеин кукурузы — 20. Многие белки в живой природе являются глобулярными.
Фибриллярные белки образуют длинные высокоасимметричные нити. Многие из них выполняют структурную или механическую функцию. Таковы коллаген (b/а — 200), кератины, фиброин.
Белкам каждой из групп присущи свои характерные свойства. Многие глобулярные белки растворимы в воде и разбавленных солевых растворах. Растворимым фибриллярным белкам свойственны очень вязкие растворы. Глобулярные белки, как правило, обладают хорошей биологической ценностью — усваиваются в процессе пищеварения, в то время как многие фибриллярные белки — нет.
Между глобулярными и фибриллярными белками отсутствует четкая граница. Ряд белков занимает промежуточное положение и сочетает в себе признаки как глобулярных, так и фибриллярных. К таким белкам относятся, например, миозин мышц (b/а = 75) и фибриноген крови (b/а = 18). Миозин имеет палочковидную форму, сходную с формой фибриллярных белков, однако, подобно глобулярным белкам, он растворим в солевых растворах. Растворы миозина и фибриногена вязкие. Эти белки усваиваются в процессе пищеварения. В то же время актин — глобулярный белок мышц — не усваивается.
Денатурация белка. Нативная конформация белковых молекул не является жесткой, она довольно лабильна (лат. «labilis» — скользящий) и при ряде воздействий может серьезно нарушаться. Нарушение нативной конформации белка, сопровождающееся изменением его нативных свойств без разрыва пептидных связей, называется денатурацией (лат. «denaturare » — лишать природных свойств) белка.
Денатурация белков может быть вызвана различными при-чинами, приводящими к нарушению слабых взаимодействий, а также к разрыву дисульфидных связей, стабилизирующих их нативную структуру.
Нагревание большинства белков до температуры выше 50°С, а также ультрафиолетовое и другие виды высокоэнергетического облучения усиливают колебания атомов полипептидной цепи, что приводит к нарушению в них различных связей. Денатурацию белка способно вызвать даже механическое встряхивание.
Денатурация белков также происходит вследствие химического воздействия. Сильные кислоты или щелочи влияют на ионизацию кислотных и основных групп, вызывая нарушение ионных и некоторых водородных связей в молекулах белков. Мочевина (H2N-CO-NH2) и органические растворители — спирты, фенолы и др. — нарушают систему водородных связей и ослабляют в белковых молекулах гидрофобные взаимодействия (мочевина — за счет нарушения структуры воды, органические растворители — вследствие установления контактов с неполярными радикалами аминокислот). Меркаптоэтанол разрушает в белках дисульфидные связи. Ионы тяжелых металлов нарушают слабые взаимодействия.
При денатурации происходит изменение свойств белка и, в первую очередь, уменьшение его растворимости. Например, при кипячении белки коагулируют и выпадают из растворов в осадок в виде сгустков (как при варке куриного яйца). Осаждение белков из растворов происходит также под воздействием белковых осадителей, в качестве которых применяют трихлоруксусную кислоту, реактив Барнштейна (смесь гидроксида натрия с сульфатом меди), раствор таннина и др.
При денатурации уменьшается водопоглотительная способность белка, т. е. его способность к набуханию; могут появляться новые химические группы, например: при воздействии мер каптоэтанола — SH-группы. В результате денатурации белок теряет свою биологическую активность.
Хотя первичная структура белка при денатурации не нарушается, изменения являются необратимыми. Однако, например, при постепенном удалении мочевины методом диализа из раствора денатурированного белка происходит его ренатурация: нативная структура белка восстанавливается, а вместе с ней, в той или иной степени, — и его нативные свойства. Такая денатурация называется обратимой.
Необратимая денатурация белков происходит в процессе старения организмов. Поэтому, например, семена растений, даже при оптимальных условиях хранения, постепенно теряют свою всхожесть.
Денатурация белков имеет место при выпечке хлеба, сушке макарон, овощей, в ходе приготовления пищи и т. д. В результате повышается биологическая ценность этих белков, так как в процессе пищеварения легче усваиваются денатурированные (частично разрушенные) белки.
Изоэлектрическая точка белка. В белках содержатся раз-личные основные и кислотные группы, которые обладают способностью к ионизации. В сильнокислой среде активно протонируются основные группировки (аминогруппы и др.), и молекулы белка приобретают суммарный положительный заряд, а в сильнощелочной среде — легко диссоциируют карбоксильные группы, и молекулы белка приобретают суммарный отрицательный заряд.
Источниками положительного заряда в белках выступают боковые радикалы остатков лизина, аргинина и гистидина, а-аминогруппа остатка N-концевой аминокислоты. Источники отрицательного заряда — боковые радикалы остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот, а-карбоксильная группа остатка С-концевой аминокислоты.
При определенном значении рН среды наблюдается равенство положительных и отрицательных зарядов на поверхности белковой молекулы, т. е. ее суммарный электрический заряд оказывается равным нулю. Такое значение рН раствора, при котором молекула белка электронейтральна, называют изоэлектрической точкой белка (pi).
Изоэлектрические точки являются характерными константами белков. Они определяются их аминокислотным составом и структурой: количеством и расположением остатков кислых и основных аминокислот в полипептидных цепях. Изоэлектрические точки белков, в которых преобладают остатки кислых аминокислот, располагаются в области рН<7, а белков, в которых преобладают остатки основных аминокислот — в области рН>7. Изоэлектрические точки большинства белков находятся в слабокислой среде.
В изоэлектрическом состоянии растворы белков обладают минимальной вязкостью. Это связано с изменением формы белковой молекулы. В изоэлектрической точке разноименно заряженные группы притягиваются друг к другу, и белки закручиваются в клубки. При смещении рН от изоэлектрической точки одноименно заряженные группы отталкиваются, и молекулы белка развертываются. В развернутом состоянии белковые молекулы придают растворам более высокую вязкость, чем свернутые в клубки.
В изоэлектрической точке белки обладают минимальной растворимостью и могут легко выпадать в осадок.
Однако осаждения белков в изоэлектрической точке все же не происходит. Этому препятствуют структурированные молекулы воды, удерживающие на поверхности белковых глобул значительную часть гидрофобных аминокислотных радикалов.
Осадить белки можно с помощью органических растворителей (спирта, ацетона), нарушающих систему гидрофобных контактов в молекулах белка, а также высоких концентраций солей (методом высаливания), уменьшающих гидратацию белковых глобул. В последнем случае часть воды идет на растворение соли и перестает участвовать в растворении белка. Такой раствор за недостатком растворителя становится пересыщенным, что влечет за собой выпадение части его в осадок. Белковые молекулы начинают слипаться и, образуя все более крупные частицы, постепенно осаждаться из раствора.
Оптические свойства белка. Растворы белков обладают оптической активностью, т. е. способностью вращать плоскость поляризации света. Это свойство белков обусловлено наличием в их молекулах элементов асимметрии — асимметрических атомов углерода и правозакрученной а-спирали.
При денатурации белка происходит изменение его оптических свойств, что связано с разрушением а-спирали. Оптические свойства полностью денатурированных белков зависят только от наличия в них асимметрических атомов углерода.
По разнице в проявлении белком оптических свойств до и после денатурации можно определить степень его спирализации.
Качественные реакции на белки. Для белков характерны цветные реакции, обусловленные наличием в них тех или иных химических группировок. Эти реакции часто используются для обнаружения белков.
При добавлении к белковому раствору сульфата меди и щелочи появляется сиреневое окрашивание, связанное с образованием комплексов ионов меди с пептидными группами белка. Поскольку эту реакцию дает биурет (H2N-CO-NH-CO-NH2), она получила название биуретовой. Ее часто используют для количественного определения белка, наряду с методом И. Кьельдаля, так как интенсивность возникающей окраски пропорциональна концентрации белка в растворе.
При нагревании растворов белков с концентрированной азотной кислотой появляется желтое окрашивание, обусловленное образованием нитропроизводных ароматических аминокислот. Эту реакцию называют ксантопротеиновой (греч. «ксантос» — желтый).
Многие белковые растворы при нагревании вступают в реакцию с азотнокислым раствором ртути, которая образует с фенолами и их производными комплексные соединения малинового цвета. Это качественная реакция Миллона на тирозин.
В результате нагревания большинства белковых растворов с уксуснокислым свинцом в щелочной среде выпадает черный осадок сульфида свинца. Данная реакция используется для обнаружения серосодержащих аминокислот и называется реакцией Фоля.