Изучение белковых веществ началось с определения их химического состава.
Белки, подобно другим органическим соединениям, состоят из небольшого числа элементов, среди которых преобладающее место занимает углерод.
В белках содержится в среднем 50—55 процентов углерода, 17 процентов водорода, 25—30 процентов кислорода, 15—19 процентов азота, 0,5—2,5 процента серы. Иногда в состав белковых веществ входят фосфор, йод, бром, железо и другие химические элементы.
В результате химического анализа было установлено, что соотношение количеств атомов химических элементов для различных белковых веществ неодинаково.
В казеине, например, мало серы, а в кератине ее много. Белок, содержащийся в тканях рыбы, богаче фосфором, чем белок куриного яйца. Гемоглобин крови содержит железо, а фиброин шелка его не имеет вовсе.
Второе открытие, сделанное химиками прошлого столетия, также показало важную особенность белковых веществ. Выяснилось, что белковые молекулы отличаются исключительно огромными размерами — они состоят из нескольких тысяч атомов. Молекулярный вес белковых молекул огромен. Например, молекулярный вес белка куриного яйца составляет 34 600, белка крови — гемоглобина — 68 000!
Есть белковые вещества, молекулярный вес которых исчисляется сотнями тысяч. Это — молекулы-гиганты, молекулы-левиафаны. Рядом с молекулой белка молекула воды, как мошка рядом со слоном. Некоторые молекулы белка настолько велики, что их можно видеть в современные (электронные) микроскопы. Например, молекулярный вес бактериофага 12 000 000. Первоначальные исследования белковых веществ показали, из каких «кирпичиков» сложены молекулы белков и сколько этих «кирпичиков» содержится в каждой молекуле.
Сведения эти ценные, но, как установил великий русский химик А. М. Бутлеров, важно знать не только количество атомов в молекуле, но и их расположение. Это — самое главное и самое трудное для исследователя природы вещества.
Химическая природа и структура двух важнейших классов органических веществ, входящих в состав живых организмов — жиров и углеводов, были обстоятельно исследованы еще в прошлом столетии.
Но химическая природа белков окончательно не выяснена и до сих пор, несмотря на то, что изучению этих веществ ученые уделили больше внимания, чем всем другим органическим соединениям.
Исследование строения белка встречает большие препятствия. Природные белки представляют собой смеси разных «сортов» белка. Получить какое-либо белковое вещество в чистом виде очень трудно.
Способы разделения веществ, которые применяются в лабораторной практике для других органических соединений — кристаллизация, возгонка, оказались непригодными для белка. Возгонка требует довольно высокой температуры, а белки при нагревании свыше 50—55 градусов свертываются, претерпевая при этом глубокие изменения. При более значительном нагревании они совершенно разрушаются.
Кристаллизация в то время также не давала положительных результатов, потому что для большинства белков не удавалось получить кристаллы. Лабораторная техника была еще очень низка.
Выяснилось, что некоторые белковые вещества можно разделить высаливанием, т. е. с помощью соли. К раствору белка добавляют насыщенный раствор какой-нибудь соли — поваренной, серноаммониевой и т. д., и из раствора начинает выделяться белок, который хлопьями падает на дно.
Раствор соли добавляют до тех пор, пока один «сорт» белка не перестанет выпадать в осадок. Этот осадок отфильтровывают и получают таким образом почти чистый белок определенного «сорта».
К оставшемуся раствору белка добавляют снова соль. Повышенная соленость заставляет другой «сорт» белка выпадать в осадок. Его тоже отфильтровывают.
В третий раз добавляют порцию соли. Выпадает третий вид белка.
Таким образом удается разделить смеси белков.
Есть и другие способы.
Некоторые белки нерастворимы в воде, но растворимы в слабых щелочах. Другие нерастворимы в щелочах, но растворимы в разбавленных кислотах. Эти различия используются для разделения белков.
Но для того чтобы быть уверенным, что полученный в осадке белок действительно представляет собой чистое вещество, его надо кристаллизовать.
Кристаллизация — замечательный помощник химика. Это надежное средство для получения чистых продуктов.
Вот, например, имеется смесь насыщенных растворов поваренной со ли и борной кислоты, и надо разделить эти вещества. Как это сделать? Очень просто: охладить растворы. Кристаллы соли борной кислоты выпадут в осадок, и их можно рассортировать даже без помощи микроскопа, просто пинцетом, потому что поваренная соль кристаллизуется кубиками, а борная кислота иголочками. И хорошо видно, где соль, а где кислота.
Поэтому химики и биологи старались научиться кристаллизовать белок. И это им удалось. Они нашли несколько способов кристаллизации белка.
Например, к яичному белку, который представляет собой смесь альбуминов и глобулинов, добавляют раствор серноаммониевой соли. Выпадает осадок. Это глобулин. Его отфильтровывают, к раствору добавляют опять немного серноаммониевой соли — образуются кристаллы альбумина.
Кристаллы белка имеют форму ромбов, шестигранных призм, иголочек.
Точно так же были получены и кристаллы других белков — оксигемоглобина из крови, сывороточною альбумина.
Кристаллы некоторых белков можно получать, растворяя белковые вещества в 10-процентном растворе поваренной соли. Если затем разбавить раствор водой, то кристаллы белка выпадут в осадок, потому что эти белковые вещества нерастворимы в воде.
Все это открыло путь к исследованию строения белковых веществ.
В последние годы советскому ученому профессору В. И. Ореховичу удалось получить совершенно чистый кристаллический белок соединительной ткани — той ткани, из которой построены кожи и хрящи.
Было известно, что под действием ферментов белковые молекулы присоединяют к себе частицы воды и распадаются на какие-то «осколки». Это явление получило название гидролиза.
Гидролиз — удобный путь для исследования. Изучив «осколки», можно понять, из каких частей состоит целая белковая молекула. Но ферменты оказались не вполне хорошими помощниками химиков. Они действуют слишком медленно, слишком неторопливо. Приходится ждать несколько недель, а иногда даже несколько месяцев, чтобы ферменты-«топорики» раскололи нужное для опытов количество белковых молекул.
В настоящее время уже найдены такие ферменты, которые позволяют так же быстро, как кислоты и щелочи, раскалывать белковые молекулы.
Такие сроки никого не устраивали. Ученые стали подыскивать «топорики» поострее. Оказалось, что белковые молекулы можно раскалывать с помощью некоторых кислот и щелочей. Под действием кислот и щелочей белковые молекулы тоже присоединяют к себе частицы воды и распадаются на «осколки», но в этом случае не нужно ждать несколько недель — достаточно нескольких часов.
Химики исследовали «осколки» белковых молекул и убедились, что эти «осколки» есть не что иное, как аминокислоты.
Аминокислоты представляют органические кислоты подобно уксусной, щавелевой и т. д. Но в отличие от последних, они содержат в своих молекулах особую атомную группу, так называемую аминогруппу, которая состоит из одного атома азота и двух атомов водорода и обладает щелочными свойствами.
Таким образом, в молекуле аминокислоты обязательно имеются две атомные группы — щелочная аминогруппа и кислотная карбоксильная группа. Поэтому аминокислоты обладают одновременно свойствами и кислоты и щелочи.
Подобные соединения получили в химии название амфотерных, т. е. двойственных. Они могут одновременно вступать в реакцию и с кислотами и с щелочами, и способны соединяться друг с другом.
Аминокислоты неодинаковы по своему составу и строению. Кроме двух характерных атомных групп, в их молекулах часто содержатся и другие атомные группы — как, например, гидроксильная группа и аминогруппа, состоящая из одного атома азота и одного атома водорода.
Аминокислоты отличаются друг от друга также и числом атомных групп и разным их расположением. Например, простейшая аминокислота гликоколь, которая содержится в белке шелка, волос, мяса, крови и во многих растительных белках, состоит всего лишь из трех атомных групп. Более сложные аминокислоты — фенилаланин, триптофан и другие — имеют в своей молекуле свыше десяти атомных групп.
В разнообразных белках, встречаемых в природе, присутствуют не одни и те же аминокислоты. В одних белках отсутствуют одни аминокислоты, в других — другие. В казеине молока вовсе нет гликоколя, а в желатине его более 25 процентов.
В настоящее время известно около тридцати различных аминокислот.
Эти аминокислоты входят в состав белков в разных количественных соотношениях. Поэтому и возможно такое многообразие белковых веществ.
Подобно тому как из небольшого числа химических элементов, располагая их в разном порядке и разных сочетаниях, можно составить сотни тысяч соединений, имеющих разные свойства, так из аминокислот можно получить тысячи, миллионы, миллиарды веществ, которые будут различаться по своим свойствам.
Из десяти аминокислот, располагая их различным образом, можно получить 3 628 000 различных белковых тел, а из двадцати аминокислот— 2 432 902 008 176 640 000.
Эти поистине астрономические числа показывают, насколько сложна химия белка. Все 100 химических элементов таблицы Менделеева не
могут образовать такого количества различных соединений, какое получается при различных сочетаниях известных науке тридцати аминокислот.
Применение учеными гидролиза дало возможность установить, что большая «сверхмолекула» белка имеет исключительно сложное строение и состоит из аминокислот.
Структура же белка оставалась неразгаданной. Ведь для того чтобы восстановить разрушенное здание, недостаточно знать, что оно было построено из кирпичей, каменных блоков, бревен и железных балок. Надо еще выяснить планировку и архитектуру этого здания. А «планировку» белковой молекулы установить не удавалось.
При гидролизе к белку присоединяется вода, и его большая молекула расщепляется на более мелкие молекулы аминокислот.
Следовательно, рассуждали ученые, обезвоживая аминокислоты, можно получить обратно белок. Если анализ ничего не может рассказать нам о структуре белка, то, может быть, завесу над тайной строения белка позволит приподнять синтез?
И ученые стали пробовать соединить аминокислоты в одну большую молекулу.
В начале XX века удалось, отнимая нагреванием у аминокислот воду, соединить их в более сложную молекулу.
Полученные вещества были названы пептидами. При соединении двух аминокислот получились дипептиды, трех — трипептиды. Соединения, состоящие из многих аминокислот, стали называться полипептидами.
При этом отдельные аминокислоты, отщепляя молекулу воды, связывались между собой через посредство группы атомов, состоящей из углерода, кислорода, азота и водорода.
Такая химическая связь получила название пептидной.
Пользуясь новым методом, химик Фишер составил из различных аминокислот десятки разных полипептидов. В 1907 году им был получен полипептид, состоявший из 18 одинаковых аминокислот, а в 1915 году один его ученик получил полипептид из 19 аминокислот. Оказалось, что свойства искусственно полученных пептидов несколько напоминают природные белки.
Они, так же как и природные белки, расщепляются под действием ферментов кишечного сока на отдельные аминокислоты.
Они так же образуют в воде клееподобные — коллоидные — растворы, а соединяясь с медью, приобретают яркую окраску.
Окрашивание белковых веществ медным купоросом стало одним из наиболее употребительных способов распознавания белков.
Обычно это делают так: к смеси белковых веществ приливают немного медного купороса и щелочи. Атомы меди вступают в соединение с белковыми молекулами. При этом образуются яркоокрашенные соединения. Если белковое вещество состоит из дипептидов, то цвет раствора станет синим. Если же в растворе находятся трипептиды или полипептиды, то он приобретает лиловый или фиолетовый цвет.
Эту реакцию соединения меди с белками называют биуретовой.
Биуретовая реакция стала надежным средством определения состава белковых веществ. Она показывает исследователю, что у него получилось— дипептиды, трипептиды или полипептиды.
Для окончательной проверки сходства искусственных полипептидов с натуральными белковыми веществами ученые попробовали кормить мышей и других мелких животных теми белками, которые они приготовили в своих колбах. Мышата ели химическую пищу без особой охоты, но вреда она им не причиняла, росли они сравнительно нормально и по всем признакам эта «пища» переваривалась и усваивалась организмом мышей. Но оказалось, что, питаясь только ею, жить нельзя, так как нет нужного «сорта» аминокислот.
То, что искусственные «полипептиды перевариваются ферментами кишечного сока, т. е. что ферменты расщепляют полипептидную цепочку на более мелкие части, служило доказательством существования пептидных связей в природном белке.
Успешный синтез полипептидов и опытное доказательство их сходства с природными белками позволили — получить более ясное представление об устройстве белковой молекулы — в ней несомненно имеются пептидные связи между аминокислотами.
Теперь, зная химический состав и строение исходных аминокислот, можно было не только определить свойства полученных полипептидов, но и выяснить их структуру.
На основании этих опытов Фишер выдвинул для объяснения структуры большой молекулы белка полипептидную теорию. Он утверждал, что молекулы аминокислот представляют отдельные звенья, которые соединяются в длинную цепочку. Эти звенья, связаны между собой пептидной связью. Если в состав полипептида входит несколько разных аминокислот, то они чередуются в цепи. Например, если обозначим буквой Г — гликоколь, буквой А — аланин, буквой С — серин, то цепь фиброина шелка должна иметь такой вид: Г-Г-А-С — Г-Г-А-С — Г-Г-А-С… и т. д. В разных белках аминокислоты чередуются в различном порядке.
Общее число звеньев подобной цепи может достигать нескольких сотен. Например, в яичном белке их будет 288, в гемоглобине 576.
Открытие Фишером пептидной связи и создание им теории цепеобразного строения белковой молекулы, казалось, давало исчерпывающий ответ на занимавший в течение многих поколений умы ученых вопрос — каково строение белка.
Многие буржуазные ученые и сейчас еще считают, несмотря на появление новых работ выдающихся советских ученых академика Н. Д. Зелинского, профессора Н. И. Гаврилова, что теория Фишера вполне удовлетворительно объясняет структуру белка и что проблема строения белка окончательно решена. Но это неверно. Полученные Фишером полипептиды не похожи на живые белки, они лишь напоминают продукты распада белка в организме.
Большую помощь ученым в исследовании структуры белка оказали рентгеновские лучи.
Еще в 1912 году начали делать рентгеновские снимки кристаллов. На фотопленке появлялись небольшие пятнышки, которые, располагаясь в определенной последовательности, давали своеобразный пунктирный рисунок. Ученые «увидели», как группы молекул слагаются в кристаллы.
Чтобы сделать рентгеновский снимок кристаллического белка, кристаллы вместе с маточным раствором внесли в микроскопические ампулы, которые были сделаны из тончайшего стекла. Ампулы запаяли и пропустили через них рентгеновские лучи.
При исследовании белков, входящих в состав гемоглобина, альбумина и других белковых веществ, с помощью рентгеновских лучей было обнаружено, что полипептидные цепи, изгибаясь, складываются в клубки. Эти белковые молекулы имели шарообразную форму. Отсюда их название — глобулярные.
Рентгеновские лучи помогли ученым определить форму белковых молекул, но не их внутреннее строение.
Дальнейший шаг вперед был сделан благодаря важному открытию выдающегося русского химика Н. Д. Зелинского.
Его открытие, сделанное в 1914 году, нанесло удар по полипептидной теории и заложило основы новой теории строения белка.