Метод глубинного культивирования обладает целым рядом преимуществ по сравнению с поверхностным выращиванием.
Механическое перемешивание и непрерывная аэрация создают благоприятные условия для доступа питательных веществ и кислорода ко всем клеткам мицелия, обеспечивая одинаково благоприятные условия для роста и накопления продуктов метаболизма. Глубинное выращивание проводится строго в определенных условиях, соответствующих физиологическим потребностям гриба, с соблюдением стерильности на всех этапах ферментационного процесса. Глубинный процесс более экономичен, так как при этом сокращается срок ферментации и увеличивается количество получаемого продукта. Однако глубинный метод требует специального дорогостоящего оборудования с высокой регулировкой ферментационного процесса, с подачей большого количества стерильного воздуха. Непрерывное культивирование в 3—4 раза ускоряет адаптацию по сравнению со стационарной культурой и способствует селекции более активных рас.
Для выращивания грибов, являющихся аэробами, в глубинных слоях жидкой культуры требуется дополнительная аэрация, так как грибы используют только растворенный кислород. Скорость перехода кислорода в раствор увеличивается с увеличением поверхностей раздела между газовой и жидкой фазами, а также с повышением парциального давления O2 в газовой фазе. Для увеличения поверхностей раздела прибегают к таким способам, как культивирование в тонком слое, перемешивание жидкости путем встряхивания (прямого или кругового), вращение сосудов вокруг их продольной оси, механическое перемешивание, пропускание воздуха через жидкость под давлением с помощью газораспределителя. В лабораторных условиях обычно используют выращивание со встряхиванием; на поступательной или вращательной качалке; в сосудах разной емкости с отбойниками; с барботажем через среду воздуха без дополнительного перемешивания среды; в ферментерах небольшой емкости (1—10 л) с продуванием воздуха и механическим перемешиванием. В промышленных условиях выращивание производят в ферментерах или системе ферментеров, достигающих в объеме от нескольких тысяч до нескольких десятков тысяч литров.
Получение посевной культуры. Одним из существенных условий успешного проведения процесса выращивания мицелия является правильная подготовка посевного материала — инокулюма. До посева на жидкую среду мицелий сохраняют на твердых питательных средах различного состава в зависимости от биологических особенностей штамма: сусловом агаре, опилках, соломе и т. д. Хранить культуру гриба лучше в холодильнике. Вегетативный мицелий съедобных грибов, как правило, не дает спороношений или спороносит слабо, что диктует необходимость засева ферментационной среды механически измельченным мицелием. Работами ряда исследователей было показано, что измельченный в смесителе мицелий, отдельные участки гиф которого состоят из нескольких клеток, в разведении 1 : 40 000 заменяет необработанный мицелий в разведении 1 : 10.
При культивировании на качалках или в ферментерах небольшой емкости посевной мицелий (инокулюм) выращивают обычно на жидкой среде в колбах Эрленмейера поверхностно или глубинно. В первом случае на дно колбы насыпают фарфоровые бусы слоем 1—2 см, наливают питательную среду так, чтобы их покрыть, и стерилизуют. Вместо фарфоровых бус можно использовать керамические цилиндрики, применяющиеся для изоляции спиралей утюгов и электроплиток. Колбы засевают мицелием с агаровых косяков. Чтобы получить однородный посевной материал, засевать колбы нужно одинаковым количеством мицелия (обычно с одного косяка засевают одну-две колбы Эрленмейера на 250—500 мл), выращивать в течение одинакового периода времени и при одинаковой температуре. После того как на поверхности бус образуется хорошая грибная пленка, ее измельчают с помощью вибратора, Шюттель-аппарата или вручную путем интенсивного встряхивания. Полученную мицелиальную суспензию стерильной пипеткой вносят в пробирки или колбы для последующей ферментации на качалке.
В случае глубинного выращивания инокулюма измельченным мицелием засевают колбы или пробирки с жидкой средой и выращивают на круговых качалках до образования заметной (в виде мелких комочков) биомассы. Затем полученную культуру пересевают пипеткой (5—10% к объему среды) в сосуды для проведения ферментации или же переливают в ферментер все содержимое одной или нескольких колб в зависимости от объема ферментера. Чтобы избежать образования длинных мицелиальных тяжей, посевную культуру можно выращивать на качалках в колбах с бусами. При этом обеспечиваются высокая плотность клеток и большое количество растущих точек.
При посеве инокулюма, выращенного поверхностно, в ферментер с перемешивающими устройствами (мешалками) можно предварительно не измельчать мицелиальную пленку, а сразу после посева включить мешалку на высокие обороты, в результате чего мицелиальная пленка будет измельчена в течение нескольких минут, а затем включить необходимую для нормального роста скорость оборотов.
Метод У. У. Доррелла и Р. М. Пейджа позволяет с помощью простого оборудования в короткий срок приготовить измельченный стерильный посевной материал из мицелия неспороносящего гриба. Выращивание гриба производится в сосуде, воздух в этот сосуд поступает через трубку и фильтр. Измельчение мицелия производится в съемном кварцевом сосуде, одетом на смеситель вместо обычного сосуда. Если нужно приготовить инокулюм для качалок или для изучения дыхания, на основу измельчителя надевают маленький колпачок из нержавеющей стали. Когда в колбе 1 будет получена развитая мицелиальная культура, трубку отключают от воздушной линии, а к распределительной бутыли присоединяют трубку с фильтром. Затем содержимое колбы по 200—300 мл за раз через трубку переливают в измельчитель, где в течение минуты производится измельчение этой порции культуры. Затем ее переливают в распределительную бутыль через трубку путем переворачивания сосуда. Эту операцию повторяют до тех пор, пока весь мицелий не будет измельчен. Затем трубку отсоединяют и мицелиальную суспензию удаляют из колбы через трубку. Измельченный в вибраторе мицелий представляет собой 3—10-клеточные кусочки, полностью живые и способные прорастать. В настоящее время созданы и более совершенные отечественные и зарубежные модели подобного рода стерильных измельчителей.
В промышленных условиях инокулюм выращивают в ферментерах-инокуляторах, содержащих несколько десятков литров питательной среды. Посевные аппараты большой емкости содержат от нескольких сотен до нескольких тысяч литров питательной среды. Ферментеры, в которых получают окончательный продукт, содержат обычно от нескольких тысяч до нескольких десятков тысяч литров ферментационной среды. Можно получать последовательно (перенося до 5% к объему среды) в лабораторном ферментере и в инокуляторе две генерации вегетативной посевной культуры. При полунепрерывном ведении процесса инокулюмом может служить культуральный мицелий, который частично оставляют в ферментере.
Контроль параметров роста. Во время ферментации ведется контроль за основными параметрами — накоплением биомассы, накоплением в мицелии белка или интересующих исследователя метаболитов, расходом питательных компонентов, изменением pH среды, аэрацией, скоростью перемешивания, температурой и др. Для контроля за накоплением и химическим составом биомассы, за потреблением из питательной среды отдельных компонентов проводят через определенные промежутки времени или по фазам роста гриба отбор проб.
Оптимальные температурный и кислородный режимы, скорость перемешивания определяют предварительно и поддерживают автоматически или регулируют с помощью имеющейся аппаратуры в заданных интервалах. Чрезвычайно важным является поддержание режима pH среды, так как резкие колебания кислотности, свидетельствующие об изменении условий культивирования или состояния культуры в неблагоприятную сторону, могут привести к быстрой гибели культуры. Согласно немногочисленным литературным данным, расход воздуха в начале ферментации составляет примерно 1 объем воздуха на 1 объем среды в 1 мин. К концу ферментации, когда накапливается большое количество мицелия, расход воздуха может быть увеличен Число оборотов мешалки составляет 150—300 в минуту и может быть увеличено к концу ферментации по мере нарастания биомассы.
Морфологические формы глубинного роста (в виде клубочков, агломератов, отдельных нитей или клеток) значительно влияют на реологические свойства культуры, что в свою очередь изменяет массообмен, обеспечение кислородом клеток мицелия. При шариковом росте, хотя поступление кислорода в среду высокое, диффузия его в шарики минимальная, и в центре шарика создаются анаэробные условия, что приводит к накоплению метаболитов и снижению урожая. При нитчатом росте, когда культура напоминает густой «суп», в культуральной жидкости наблюдаются переплетенные, ветвящиеся отрывки мицелия или тяжи, могущие образовывать агломераты. Эти структуры во многом зависят от разбивающего действия ферментера, питательной среды, pH и могут быть диспертированы простым разведением. При возрастании плотности клеток и длины гиф возрастает вязкость, падают турбулентность и массообмен. Клеточные агломераты требуют высокого уровня кислорода, чтобы обеспечить диффузию его в клетки, находящиеся в центре. Было показано, что в маленьких ферментерах очень высокая вязкость «супа» не может адекватно аэрироваться. Оптимальная температура для роста мицелия у многих видов отмечается в пределах 25—28° С.
Если в процессе ферментации образуется обильная пена, то одновременно с внесением посевного материала в культиватор добавляют пеногаситель (например, подсолнечное масло в количестве 0,05—0,1% к объему среды). По мере образования пены в среде можно добавлять пеногаситель и в процессе ферментации.
Одной из сложных и не решенных до конца задач является придание мицелиальной массе товарного вида — получение сухого мицелия, частичное обезвоживание с последующим консервированием, получение обезвоженного прессованного мицелия и т. д. Способ обработки мицелиальной массы зависит главным образом от назначения получаемого продукта. Для получения грибного порошка, используемого в качестве приправы, применяют лиофильную и другие виды сушки. Р. Ф. Робинсон и Р. С. Дэвидсон рекомендуют проводить сушку при 110° С; для обезвоживания используют центрифугирование и т. д. При этом одной из важных задач является сохранение у конечного продукта аромата и вкуса съедобного гриба.
Грибной аромат. Пищевое использование культурального мицелия в значительной степени зависит от наличия грибного аромата как в свежем, так и в консервированном продукте. Поэтому с первых же шагов по глубинному культивированию мицелия съедобных грибов для пищевых целей большое внимание уделялось сохранению и усилению грибного аромата.
Еще в 1954 г Д. Зюсом был получен патент на усиление грибного запаха. Для этой цели он предлагал выращивать мицелий на оптимальной среде с добавлением лецитиновой эмульсии или любых других съедобных жиров. Для усиления запаха влажный выросший мицелий (90% воды), отделенный от питательной среды, предлагалось также смешивать с поваренной солью, добавляемой в количестве не менее 2%, а лучше 4% по массе. По мнению Д. Зюса и Н. Йонкерса, поваренную соль можно заменить любыми другими пищевыми солями или другими средствами, нарушающими рост и метаболизм грибного мицелия. Нагревание мицелия до 60—80° С было неэффективным, так как разрушало запах. На усиление запаха, по мнению ряда исследователей, оказывают влияние процессы автолиза, дикариотичное состояние мицелия, добавление в питательную среду таких стимуляторов, как мальц-экстракт, дрожжевой экстракт, экстракт из проростков ячменя, 1—10% снятого молока и т. д.
Проведенные химические исследования ароматических веществ в плодовых телах шампиньона, опенка, белого гриба, дождевика гигантского, вешенки обыкновенной, рядовки фиолетовой, навозника хохлатого и других установили, что основу грибного аромата этих грибов создают 1-октен-3-ол, гуанозин-5-монофосфат (5-ГМФ), а также глутаминовая кислота, запах которой в значительной степени стимулируется двумя первыми соединениями. Другие химические компоненты, возможно, создают специфику запаха каждого вида. У Lentinus edodes, запах которого значительно отличается от запаха других съедобных грибов, было изолировано вещество лентионин.
Было показано, что наличие этих же веществ обусловливает грибной аромат культурального мицелия и культуральной жидкости при глубинном выращивании, причем у некоторых видов культуральный мицелий более богат ароматизирующими веществами, чем плодовые тела. Этим же автором было установлено, что при глубинном культивировании шампиньона и навозника хохлатого 1-октен-3-ол образуется на более ранних этапах роста, а 5-ГМФ — значительно позднее, что связано, очевидно, с автолизным разрушением РНК. Усилению запаха и одновременно увеличению продукции мицелия способствует использование в качестве питательной среды овощных экстрактов, являющихся отходами, обогащенными углеводами. Обнаружены заметные количественные различия в образовании ароматических веществ у разных штаммов и подчеркивается целесообразность дальнейших поисков продуцентов грибного аромата.
Возможность искусственного синтеза грибного аромата помогла бы с большой эффективностью использовать культуральный мицелий быстрорастущих в культуре съедобных грибов, которые сейчас отвергаются из-за недостаточно интенсивного запаха.
Непрерывное культивирование. Основные известные работы по глубинному культивированию мицелия съедобных грибов выполнены с использованием метода периодического глубинного культивирования, т. е. статической культуры, с характерными для нее фазами, описанными выше. Этот метод, несмотря на значительные преимущества по сравнению с поверхностным культивированием, имеет ряд недостатков, связанных с быстрым потреблением питательных веществ и накоплением продуктов метаболизма, что значительно тормозит дальнейший рост мицелия. Необходимость возобновления процесса после каждой ферментации удорожает процесс и создает дополнительную возможность инфицирования посторонними микроорганизмами. В настоящее время разрабатывается непрерывный способ культивирования некоторых мицелиальных грибов. Непрерывное культивирование является новым этапом в культивировании микроорганизмов и, хотя оно более детально разработано пока для дрожжей и бактерий, мы считаем необходимым осветить основные принципы этого метода, как дающего возможность значительно ускорить рост мицелия и получать биомассу с заданными свойствами.
Преимущества непрерывного культивирования заключаются прежде всего в возможности постоянной поддержки высокой скорости роста, редко возникающей потребности в возобновлении процесса, возможности автоматического поддержания заданных оптимальных условий, стандартности получаемого продукта, экономичности обслуживания процесса и т. д. Если статическая культура рассматривается как закрытая система, которая в своем развитии проходит через начальную, экспоненциальную, стационарную фазы и фазу отмирания, где каждый из этих периодов характеризуется определенными условиями, то непрерывная культура представляет собой открытую систему, стремящуюся к установлению динамического равновесия. Фактор времени в непрерывной культуре в известной мере исключается. Для организмов создаются неизменные условия среды.
В том случае, когда целью является получение большого количества биомассы, обычно используют простейшую, одноступенчатую систему непрерывного культивирования, при которой культуру выращивают на каком-то одном определенном субстрате, обеспечивающем максимальный выход биомассы. Если желаемый продукт образуется в результате двух или более метаболических превращений, используют многоступенчатую систему непрерывного культивирования. Полунепрерывные системы основаны на принципе повторного и последовательного периодического культивирования, производимого в одном или нескольких культиваторах, соединенных в батареи. Теоретической основой для промышленных процессов непрерывного культивирования является управление поведением популяции.
Изучение влияния внешних факторов на синтетическую и другие виды активности микроорганизмов стало возможным благодаря появлению хемостатического метода культивирования. По этому методу выращивание производится при воздействии на культуру одного фактора и оптимизации всех остальных.
Снижение концентрации лимитирующего фактора на 50% пропорционально уменьшает плотность популяции. Удвоение концентрации остальных питательных веществ не должно влиять на плотность популяции. И. Л. Работнова отмечает, что при лимитации роста различными элементами питания происходят большие изменения в составе клеток как в зависимости от скорости роста, так и в зависимости от лимитирующего фактора. Выявление принципиальных закономерностей этих изменений открывает широкие перспективы для управления составом биомассы. При непрерывном методе выращивания культура длительно находится в состоянии «физиологической молодости».
В тех случаях, когда необходимо достичь максимально возможной скорости роста под влиянием тех или иных факторов, используется турбидостат. Работа турбидостата основывается на поддержании постоянной плотности культуральной суспензии, или постоянной мутности. Фотоэлемент, измеряющий мутность, регулирует через систему реле поступление питательного раствора. В сосуде для культивирования все питательные вещества содержатся в избытке, и скорость роста культуры приближается к максимальной. При помощи турбидостата открывается возможность для разработки проблемы быстрого и сверхбыстрого роста.
Развитие в последнее десятилетие новых методов культивирования микроорганизмов в жидкой среде обусловило общий прогресс в этой области и поставило целый ряд новых проблем в технологическом (аппаратурном) решении процессов выращивания мицелиальных грибов. Использование этих новых методов при выращивании мицелия съедобных грибов позволит решить задачу значительного ускорения роста мицелия и дальнейшего совершенствования его питательных свойств.