Все исследователи, работавшие с термофильными микроорганизмами, отмечают, что явление термофилии распространено среди грибов весьма редко.
Неудивительно поэтому, что до сих пор описано небольшое число видов грибов, способных размножаться в зоне повышенных температур. Большинство из так называемых «термофильных» грибов, как мы это увидим ниже, кончает развиваться при 50—55°, т. е. являются термотолерантными, и лишь единичные виды растут в пределах 60—63°. Последняя группа грибов тоже весьма условно может быть названа термофильной, так как для типичных термофилов зона оптимума находится при 60° и близком к данной температуре интервале.
На подобные организмы обратил внимание Линдт, описавший грибок Mucor pusillus, выделенный из хлеба, находившегося при 37°. Довольно хорошее развитие мицелия данного гриба при температуре, задерживающей рост обычных сапрофитных грибов, невольно заинтересовала Линдта.
Значительно позднее Глобиг (1888) отметил появление белых грибообразных налетов на картофеле, зараженном почвой и помещенном в термостат. Этот гриб не был подробно описан, и не исключена вообще возможность, что Глобиг имел дела с термофильным актиномицетом.
В 1899 г. Циклинская изолировала теплолюбивый грибок Thermomyces lanuginosus с оптимальной температурой, лежащей в пределах 54—55° и максимумом около 63°. Гриб является наиболее термофильным из всех описанных до сих пор. По формальным признакам он может быть назван термофильным, так как, несмотря на относительно низкий максимум, все же не развивается при температурах более низких, чем 37°. Thermomyces был выделен из ломтиков яблока, зараженных почвой и стоявших при высокой температуре.
С термофильными грибами довольно много работал Миэ (1907), исследовавший процесс самонагревания сена. Грибы его интересовали как представители определенного микробного ценоза, связанного с явлением термогенеза. Он описал несколько термофильных грибов, имевших температурный максимум около 55°. Из новых видов следует отметить Thermoascus aurantiacus и Thermoidium sulfureum. Последний микроорганизм был обнаружен сотрудником Миэ Шнейдером, но подробное его изучение было произведено самим Миэ.
Как оказалось, некоторые из грибов, ранее описанных другими исследователями, могли развиваться при довольно повышенной температуре; так, например, максимальная температурная точка у Mucor pusillus, Aspergillus fumigatus и Mucor corymbifer была найдена Миэ лежащей около 50-55°.
Наиболее интересные теплолюбивые грибы, описанные Миэ и другими исследователями, будут нами несколько подробнее описаны ниже.
В 1912 г. Ноак (Noak) выделил из греющегося сена с температурой 45—46° теплолюбивый грибок, который, однако, более подробно изучен не был.
Весьма обстоятельные исследования термофильных грибов были проведены Мальчевской под руководством Исаченко (1939). Изучая самонагревание торфа, Мальчевская пришла к выводу, что в данном процессе значительную роль играют грибы, многие из которых способны развиваться при повышенной температуре. Она описала три новых вида грибов, росших до 50°. Это были Citromyces sphagnicola, Micromucor naumovi и Thermoasus issatschenkoi. Кроме этого, в зоне 40—50° достаточно хорошо развивались следующие ранее описанные грибы: Citromyces cyaneus Bainier, С. minutus Bainier, Lichtheimia cornealis (Mucor cornealis) Naumov, Mucor hiemalis Wehmer, Penicillium olivaceum Wehmer, P. acidoferum Sopp.
Термофильными грибками почвы и компостов занимался Ваксман со своими сотрудниками (1931—1939). Производя анализы греющегося навоза и компостов, Ваксман не мог в них найти грибков, растущих при 65°. Однако в тех случаях, когда температура компостов не превышала 50°, грибы обнаруживались в чрезвычайно большом количестве. Их число нередко достигало 200 млн. на 1 г компостируемой массы.
Из наиболее теплоустойчивых грибов оказались формы, весьма близкие к описанным Циклинской (род Thermomyces). Ваксман довольно подробно изучил биохимические свойства выделенного им гриба из рода Thermomyces, который в чистой культуре мог разлагать гемицеллюлозу, целлюлозу и даже лигнин.
Биохимическая активность термофильных грибов, по данным Ваксмана, значительно выше, чем мезофилов. Поэтому следует думать, что в пределах определенной температурной зоны теплолюбивые грибы в самонагревающихся органических массах вызывают существенные изменения находящихся там соединений.
При нашей экспериментальной работе в компостах, разогревавшихся до 60—65°, грибы никогда не обнаруживались ни методом прямого микроскопирования по Холодному, ни методом посева. При более низкой температуре, (около 50°) налеты грибного мицелия могли быть обнаружены визуально.
Приведенный материал, несмотря на его скудность, все же позволяет заключить, что в зоне максимально высоких температур (60—75°) термофильные грибы никакой роли не играют. Если греющиеся массы имеют температуру, не превышающую 55°, то в некоторых их слоях, обеспеченных притоком кислорода, теплолюбивые грибы могут активно развиваться и принять деятельное участие в трансформации органических веществ. Эта группа микроорганизмов энергично разлагает белки, углеводы (вплоть до клетчатки) и даже лигнин.
В компостах, имевших температуру около 50°, Ваксман и его сотрудники отмечали развитие грибов из родов Monotospora, Acremoniella и Sepedonium. Так как эти микроорганизмы более подробно изучены не были, его мы их в приведенную таблицу не включили.
Ниже приводим характеристику грибов, свойственных разогревающимся массам и описание которых, как правило, не дано в наиболее распространенных определителях грибов.
Гриб Thermomyces описанный Циклинской, был позднее изучен также Миэ. На основании работ этих исследователей ему может быть дана следующая характеристика. Thermomyces должен быть отнесен к несовершенным грибам. Свое название он получил за пушистый мицелий (lanugo — пух). При старении, правда, колония становится более компактной. Мицелий гриба при благоприятной температуре развивается весьма быстро и через 24 часа после посева даст достаточно крупную колонию. Цвет молодого мицелия снежнобелый. При образовании конидий колония приобретает серовато-зеленый или коричневатый тон.
Гриб растет на обычных питательных средах, как жидких, так и твердых. Не плохо он развивается на белом хлебе, но особенно пышно мицелий формируется на картофеле.
Сенной отвар представляет собой недостаточно подходящую питательную среду. На аспарагиновой среде при наличии хорошего роста отмечается окрашивание субстрата в красный тон.
Желатина медленно разжижается. Гриб инвертирует сахарозу, но не имеет амилазы. Молоко свертывается при подкислении, но позднее разжижается.
Гифы гриба разветвленные, шириной 1.5—3.0 μ. Весьма характерны споры, сидящие на коротких конидиеносцах. Первоначально они тонкостенны, прозрачны и бесцветны. Позднее покрываются толстой коричневой бугристой оболочкой. Размер спор 6—10 μ. С внешним видом спор описываемого гриба достаточно хорошо знакомят читателя рисунки 36—40.
Циклинская отмечает, что споры образуются только на твердых питательных средах. Очевидно, у некоторых разновидностей гриба споры имеют гладкую поверхность.
Как уже отмечалось, Thermomyces lanuginosus наиболее термофильный из описанных до сих пор грибов. При 30° егб споры не прорастают, но мицелий может слабо развиваться. Около 60° находится его температурный потолок. Такие сведения дает на основании своих опытов Миэ. Культура, имевшаяся у Циклинской, имела температурный минимум около 37° и кончала развиваться при 63°.
Другой гриб — Thermoascus aurantiacus, изолированный Миэ с гревшегося сена, на котором он образовывал оранжевые пятна. Особенности гриба не позволили Миэ его присоединить к какому-нибудь ранее описанному роду. Развитие его Миэ изучал главным образом на питательных жидких средах.
При росте на сахаро-аспарагиновом растворе при 50° гриб дает первоначально белую пленку, состоящую из переплетенных гиф, в которых часто встречаются вздутые клетки. Наиболее часто они имеются в конечных клетках мицелия. Вздутые клетки имеют яйцевидную или продолговатую форму. Оболочки этих клеток утолщены, почему их внутреннее содержимое до известной степени сжато.
При 40° вздутые клетки не образовывались. Тонкая кожистая пленка в данном случае состояла из мицелия, имевшего длинные клетки толщиной до 12.5 μ. От них в сторону отходили более тонкие отростки толщиной 1.5—5.0 μ. При старении пленка окрашивается в оранжево-красноватый тон и получает вздутый складчатый характер.
На сенных средах (жидком и агаризованном отварах) гриб развивается слабее. Мицелий лишь пятнами окрашивается в оранжевый тон. Оранжевая окраска свойственна перитециям, имеющим неправильную, угловатую форму и неровную поверхность. Их размер 0.25 X 1 мм. На срезах видно, что оболочка перитеция состоит из псевдопаренхиматической ткани, сформированной из разветвленных, раздутых гиф, окрашенных в красно-коричневый тон. Перитеции содержат аски, в каждом из которых имеется по восемь спор. Споры гладкие и не пигментированы. Из созревших асков споры вываливаются, и большая их масса заполняет пространство перитеция. Для диагностики вида Миэ особенно рекомендует применять сенные среды. При 50° гриб плодовых тел не образует и остается непигментированным. Образования конидий никогда не отмечалось. Миэ считает его представителем аскомицетов.
При 25—30° роста не отмечается в течение четырех суток. Между 40—45° гриб развивается весьма интенсивно. При 50° признаки роста имеются, но спор не образуется. Свыше 55° развития не происходит.
Thermoascus issatschenkoi, описанный Мальчевской, отличается от гриба, выделенного Миэ, более низкой температурой развития и бесцветным пушистым, ватообразным мицелием, который с трудом снимается с питательной среды иглой.
Мицелий у данного гриба имеет слабо заметные перегородки с включениями жировых капель и вакуолями. Его ширина 3.5—7.0 μ. Многочисленные перитеции, образующиеся в колонии, характеризуются длиной 34 μ и шириной 17 μ. Этот гриб хотя и не развивается при значительно повышенных температурах, но при комнатных условиях также не растет. По данному признаку он должен быть отнесен к термофильным организмам.
Гриб Thermoidium sulfureum был изолирован Миэ из разогревавшихся растительных остатков. Он образует на разлагающейся массе желтоокрашенные хлопьевидные обрастания. При культивировании на агаровой среде при 40° вырастает белый или слегка розоватый многоклеточный мицелий. Позднее он становится серо-желтым и даже коричневым. Поверхность колонии делается мучнистой.
Для гриба характерна способность придавать среде, содержащей сахар, кармино-красную окраску, переходящую, затем в коричнево-красную, и позже — в грязноватую. Со временем мицелий септируется, и отдельные участки его превращаются в споры. Яйцевидные или цилиндрические споры покрываются плотной оболочкой. Пигмента они не имеют.
При образовании спор мицелий гриба весьма часто спиралевидно закручивается. Не образующая спор часть мицелия наполняется желтой рассыпчатой массой и отмирает. В старой культуре мучнистый налет сплошь состоит из спор. Их длина 2.5X10 μ, при ширине 2.5—3 μ.
Споры гриба прорастают чаще с одной и реже с двух сторон. При 24°. гриб развивается очень медленно. Даже через три недели на среде образуются слабые, анормального вида хлопья мицелия. При 26—27.5° развитие также идет замедленно. Более благоприятна температурная зона в 29—30°, но и здесь прорастание спор и рост молодого мицелия осуществляется не быстро. Наиболее благоприятна температура 35—45°. Удовлетворительный рост наблюдается при 50°, но спорообразование бывает при этом подавлено. Верхняя температурная граница у этого гриба находится около 53°.
Можно отметить, что иногда у описываемого гриба мицелий дает булавовидные образования. Смысл этого явления остается невыясненным. Миэ. указывает, что подобную картину он наблюдал у других грибов и не считает ее характерной для Thermoidium sulfureum.
Термофильный вариант гриба, близкого к Oidium lactis Fres., Миэ выделил тоже из греющегося сена. К 40° этот гриб уже переставал развиваться. При 42° он погибал после суточного пребывания в данной обстановке.
Aspergillus fumigatus Fres. достаточно полно описывается во многих руководствах. Это обычный мезофил с повышенным температурным максимумом. Гриб патогенен для людей и животных.
Mucor pusillus Lindt встречается весьма нередко на греющихся субстратах. Часто он загрязняет чашки с питательными средами, стоящими при температуре около 40°. При комнатной температуре он не растет в продолжение нескольких недель. Медленное развитие наблюдается при 24°. До 40° рост усиливается, но дальнейшее повышение температуры уже действует неблагоприятно. Максимальная температура близка к 55°. Подробное описание гриба имеется в существующих определителях («Определитель мукоровых грибов» Наумова и др.), где можно также найти нужные сведения о другом представителе данной группы — Mucor corymbifer. При 40° этот вид развивается достаточно хорошо, но хуже, чем Mucor pusillus. При 50° рост получается очень слабый, а при более высоких температурах прекращается совершенно. При обычной температуре растет хорошо. Споры, введенные в кровь кролика, вызывают у него появление болезненных явлений.
К мукоровым грибам относится также Lichtheimia cornealis (Mucor cornealis), описанный Наумовым. Этот гриб может развиваться при комнатной температуре, но имеет повышенный максимум, лежащий около 50°. Аналогично относится к температуре и Micromucor naumovi, описанный Мальчевской.
Шапошников и Мантейфель (1923) описали оригинальный вид Penicillium arenarium n. sp., несколько напоминающий P. olivaceum Wehmer, но отличающийся от него рядом признаков. В частности, Р. arenarium имеет весьма крупные конидии (3.5—6.0 х 6.0—11.0 μ), крайне ацидофилен и хорошо развивается при 40°. Данный гриб представляет практический интерес, так как вырабатывает из сахара лимонную кислоту.
Так как грибы, развивающиеся при повышенной температуре» были достаточно полно описаны в настоящем разделе, то их характеристика в определителе, приложенном к настоящей монографии, опускается. Культивирование термофильных грибов и дрожжей производится на общепринятых средах.
С еще большей условностью, чем к грибам, понятие «термофилии» может быть приложимо к дрожжам. Тем не менее некоторые исследователи описали, так называемые «термофильные дрожжи». Так, Джонсон и Хар (Johnson и Hare, 1905), заразившие пивное сусло листьями эвкалипта, обнаружили в среде, нагретой до 84°, брожение. На дне сосуда образовался осадок, из которого был выделен новый вид дрожжей, названный Saccharomyces thermantitonum. Дрожжи имели круглые или яйцевидные клетки и по многим признакам были похожи на Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus. Однако они развивались при довольно высокой температуре. Так, температурный оптимум у Saccharomyces thermantitonum находился между 39 и 45°, максимум приближался к 50°, а при 25° отмечалось развитие, хотя несколько замедленное. При 55° рассматриваемые дрожжи отмирают после их пребывания при данной температуре в течение 22 часов.
Очевидно, вид Saccharomyces thermantitonum свойственен тропическим странам. Впоследствии эти дрожжи были изучены рядом исследователей.
Интересно отметить, что через 14 лет после изоляции Saccharomyces thermantitonum Эйлер и Лаурин установили, что оптимальная температурная точка у них несколько снизилась. Дрожжи лучше росли при температурах, приближающихся к 35°, чем при 40°.
Еще позднее, в 1931 г., Штеллинг-Деккер констатировала их неспособность развиваться при 40°. Устойчивость клеток Saccharomyces thermantitonum к нагреванию была невысока. На основании своих наблюдений Штеллинг-Деккер заключает, что кардинальные температурные точки не являются достаточным признаком для выделения того или иного микроорганизма в особый вид. Постепенно при лабораторных условиях культивирования их положение может существенно меняться.
Штегер и Глаубиц (Staiger u. Glaubitz, 1930) все же могли отметить большую устойчивость клеток Saccharomyces thermantitonum к повышенной температуре. Тем не менее приходится признать, что за 25 лет культивирования дрожжей их кривая развития передвинулась в сторону более низких температур.
Можно указать, что Гиллермон (Guilliermond) в своей систематике переименовал Saccharomyces thermantitonum в Torula thermantitonum Johnson. Имшенецкий считает, что это было сделано без достаточных оснований, так как систематическое положение разбираемых дрожжей, образующих на картофеле аски с 1—4 спорами, не вызывает никаких сомнений.
Совсем, недавно Одинцова (1947) описала другой термофильный дрожжевой организм — Endoblastomyces thermophilus, изолированный из накопительной культуры молочнокислых бактерий в Средней Азии. Развиваясь на сусле, эти дрожжи дают белый, слегка кремовый матовый налет. В налете находятся почкующиеся дрожжевидные клетки удлиненной формы. Иногда клетки принимают грушевидную форму. Культура обладает способностью врастать в агар, где образует хорошо развитой ложный мицелий. На мицелии имеются дрожжевидные конидии. Старая культура способна давать воздушный мицелий, состоящий из длинного мицелия, лишенного конидий.
Для описанного организма характерна способность в стадии мицелиального роста давать конидии (при глубинном росте), а также образовывать эндогенные дрожжевидные клетки. Конидии и эндогенные дрожжевые клетки в полном цикле развития Endoblastomyces thermophilus представляют собой переходную форму от мицелиальной стадии к стадии дрожжевидной. Для обозначения эндогенных клеток Одинцова предложила термин «эндобласт», а для гигантских конидий — «экзобласт».
Наименование грибка подчеркивает, что он способен производить эндобласты. Одинцова установила, что эндобласты развиваются в клетке из спороподобных образований. Предшествующие этому изменения протопласта напоминают спорообразовательный процесс у дрожжей. Endoblastomyces thermophilus для своего развития требует наличия кислорода, хотя способен вызывать довольно энергичное брожение. Из углеводов он хорошо сбраживает лишь моносахариды и несколько хуже использует сахарозу. Может питаться минеральным и органическим азотом.
Накопительная культура дрожжей могла развиваться при температуре 48°, однако после очистки максимальная температура не превышала 44°. При многолетнем выращивании в лаборатории Endoblastomyces thermophilus сохранил способность хорошо расти при 42—44°, и эту зону Одинцова считает близкой к температурному оптимуму. Как и все термофильные микроорганизмы, рассматриваемая культура дрожжей при благоприятных условиях размножается весьма быстро. Обычные условия не прекращают роста культуры, но он совершается замедленными темпами.
Дрожжи, способные развиваться в зоне высоких температур, представляют большой практический интерес. Среди них, однако, в настоящее время отсутствуют виды, вызывающие энергичное спиртовое брожение. Это заставляет с вниманием отнестись к попыткам Логиновой (1948) приучить XII расу Saccharomyces cerevisiae к росту при повышенной температуре. Логиновой удалось при постепенном повышении температуры вывести культуру, энергично развивающуюся при 40°. Таким образом, точка оптимума была поднята примерно на 8—10°. Энергия их брожения сохранилась на уровне, свойственном исходной культуре. При обычных условиях адаптированная культура давала тот же выход спирта, что и нормальные дрожжи. Дрожжи, выведенные Логиновой, с успехом могут быть использованы для производства в местах с жарким климатом.