Л. В. Крюгер, И. А. Селиванов
Давно высказывались предположения о принадлежности грибов, образующих эндомикоризы у травянистых растений, к фикомицетам из сем. Endogonaceae (Бухгольц, 1911; Thaxter, 1922; и др.), но только в пятидесятых-шестидесятых годах нашего столетия это подтверждено экспериментально.
Эндогоновые грибы — обширная группа почвенных микромицетов, по-видимому, имеющая эврихорное распространение. Однако биология этих грибов изучена еще очень слабо. Известно лишь, что большинство видов эндогоновых грибов являются микоризообразователями. Есть виды, которые ведут паразитический образ жизни (преимущественно на сфагнумах), некоторые могут быть сапрофитами на растительных остатках или трупах насекомых (Dowding, 1955, 1959).
В цикле развития большинства эндогоновых грибов можно четко различить две фазы: биотрофную (симбиотрофную или паразитическую) и сапротрофную. Биотрофная фаза связана с живым растением-хозяином, преимущественно с его корневой системой, где гриб существует в форме мицелия, арбускул и везикул. Сапротрофная фаза протекает в почве или в растительных остатках, где происходит формирование зигоспор, хламидоспор, спорокарпов, являющихся органами перенесения неблагоприятных условий.
До последнего времени главное внимание уделялось изучению биотрофной фазы в развитии эндогоновых грибов. Довольно детально изучено анатомическое строение эндойикориз у очень большого числа высших растений, различных в систематическом, экологическом и географическом отношениях. У многих растений изучена динамика микоризообразования. В частности, выяснено, что первичное заражение корней микоризными грибами происходит из почвы и начинается чаще всего в фазе 3—4 листьев. В корни гриб проникает через прободение эпиблемы и через корневые волоски. Наши исследования микоризообразования у эфемероидов лесной и пустынной зон, как и наблюдения за зимним состоянием фикомицетных эндомикориз, показали, что зимой и ранней весной, только что выйдя из-под снега, все травянистые многолетние растения (за исключением крестоцветных, осоковых и некоторых других) содержат довольно большое количество мицелия и везикул в тканях корня, что свидетельствует о возможности сохранения микоризного гриба в неотмирающих на зиму частях корневой системы.
Заражение вновь формирующихся корней, по-видимому, может идти двумя путями: из почвы, где гриб переносит неблагоприятные условия в стадии спорокарпов и хламидоспор, и за счет старых корней, где он сохраняется в стадии мицелия и многочисленных везикул.
Изучение локализации эндофитных грибов в вегетативных и генеративных органах у целого ряда растений (Крюгер, 1969) позволило сделать вывод, что микоризных грибов в генеративных органах нет. Следовательно, развиваемая некоторыми учеными гипотеза о передаче эндофитного гриба из поколения в поколение через семена не подтвердилась полученными фактами.
Серией опытов по заражению стерильно выращенных сеянцев пшеницы и гороха микоризными корнями целого ряда растений (Крюгер и др., 1968, 1971, 1973) удалось выяснить, что эндофитные корневые фикомицеты не приурочены к какому-либо определенному растению-хозяину и могут образовывать эндомикоризы у широкого круга кормофитных симбионтов. Об отсутствии узкой специализации грибов, образующих эндомикоризы, говорит и тот факт, что у травянистых растений разных физико-географических областей (Урал, Кольский полуостров, Кавказ, Крым, Средняя Азия, Памир, лесостепное Зауралье, Западная Сибирь, Подмосковье) эндомикоризы весьма сходны в морфологическом и анатомическом отношениях и образованы, видимо, одними и теми же или очень близкими видами грибов.
Изучение микориз оранжерейных и комнатных растений, среди которых преобладают виды тропического происхождения, показало, что и у них, в условиях культуры, вдали от их родины, хорошо развиты везикулярно-арбускулярные микоризы. То же самое можно сказать об изучении микотрофизма интродуцированных и акклиматизированных растений Батумского, Ташкентского, Новосибирского и Пермского ботанических садов. Эти факты можно объяснить только широкой экологической амплитудой грибов-микоризообразователей и отсутствием у них узкой специализации по отношению к зараженным ими растениям. Следовательно, фикомицетные ризомицеты являются относительно неспецифичными симбионтами. Отсутствие узкой специализации у эндомикоризных грибов не означает, однако, что все ризомицеты будут иметь одинаковое влияние на рост растения-хозяина (Mosse, 1972а, в).
Сапротрофная фаза в развитии эндогоновых грибов начинается с формирования спорокарпов, зигоспор или хламидоспор. В природе спорокарпы эндогоновых грибов встречаются в разных условиях. Их находят на мхах, особенно сфагновых. Они обитают в листовой подстилке, под опавшей и слегка разложившейся хвоей. В 1972—1974 гг. нами сделаны попытки выделить эндогоновые грибы из ризосферы, мертвой подстилки и почвы некоторых растительных сообществ на биостанции «Верх-Кважва» (Добрянский район Пермской области) в окрестностях Перми. Больше всего покоящихся стадий эндогона (зигоспор и хламидоспор) найдено в мертвой подстилке в ольшаннике, на берегу реки Кважвы, особенно около корней щучки дернистой, гравилата приручьевого и лабазника вязолистного. Находили их также в окрестностях станции Адищево в смешанном лесу, у основания стебельков мхов.
В распространении эндогонов в природе, по-видимому, существенная роль принадлежит животным. Dowding (1955, 1959) обнаружила большое количество эндогоновых спор в желудках мышей, кротов, белок, землероек, леммингов, горных кроликов, в пищеварительных органах жуков-скарабеев и других насекомых. Возможно, что плодовые тела эндогоновых грибов животные заглатывают, поедая корни микотрофных растений. Вероятен и другой путь: насекомые поедают спорокарпии эндогонов, а потом сами становятая пищей грызунов.
Сапротрофная фаза в развитии эндогонов изучена крайне недостаточно и требует интенсивных и планомерных исследований эндогоновых грибов как в природных условиях, так и в культуре. Для этого в настоящее время создались благоприятные условия, так как разработаны методы извлечения спорокарпов и хламидоспор из почвы и отмирающих частей растений.
Простейшим является метод прямого отбора спор и спорокарпов из почвы и лесной подстилки под лупой или бинокуляром. Но этот способ мало продуктивен из-за больших затрат времени на поиски нужных объектов.
Второй метод — метод влажного просеивания — заимствован Гердеманом (Gerdemann, 1955) из практики изучения фитопатогенных нематод. Сущность метода состоит в следующем. Пробу почвы объемом 250 см3 взбалтывают в 1 литре воды. Через несколько секунд взмученная жидкость процеживается через почвенное сито с крупными отверстиями. Полученная почвенная суспензия вновь, взмучивается и процеживается через сито с меньшими отверстиями и т. д. Большинство спор эндогоновых грибов имеют диаметр от 150—250 до 400—450 микрон, поэтому на такие фракции обращают основное внимание.
Дебрис с сита переносят в чашки Петри с тонким слоем воды и просматривают его под бинокулярным микроскопом, выбирая споры препаровальной иглой с плоским кончиком. Подобная процедура довольно трудоемка: чтобы найти 100 спор, приходится затратить рабочий день.
Существенные изменения в методику влажного просеивания и фильтрования внес Оме (Ohms, 1957), предложивший так называемый флотационный способ — расслаивания и центрифугирования. Первые этапы работы — приготовление почвенной суспензии и ее процеживание — ведутся по Гердерману (1955), но затем фракция частиц, остающихся на сите с отверстиями 0,177 мм, суспензируется в воде, взмучивается, а после осаждения тяжелых частиц центрифугируется. После этого на дно другой — 50-миллиметровой центрифужной пробирки наливается 10 мл 50%-ного раствора сахарозы, а затем осторожно по вертикальной стенке шприцем с изогнутой стеклянной трубкой добавляется 15 мл 25%-ного раствора сахарозы, а сверху—10 мл воды. В эту же пробирку добавляется 15 мл суспензия с наиболее легкими почвенными частицами и дебрисом. После центрифугирования, проводимого в течение б минут при 3100 оборотах в минуту, споры осядут в среднем слое, а почвенные частицы — на дно. Споры из среднего слоя пипеткой переносят в чистую пробирку или мензурку, добавляют воды, чтобы уменьшить удельный вес раствора. Осевшие споры промываются водой. За день этим способом можно отобрать примерно более 2000 спор.
Большая трудность исследования эндогоновых грибов заключается, во-первых, в том, что находимые в почве споры и спорокарпы в лабораторных условиях обычно не прорастают, а во-вторых, в том, что находящиеся в фикомицетных микоризах эндофитные грибы вне живого растения-хозяина не растут.
Одним из важных условий культуры эндогонов является отбор спелых спорокарпов, максимальное количество которых, судя по литературным данным (Mosse, 1954, 1956, 1959; Godfrey, 1957; Gerdemann, 1955, 1968; и др.), созревает в сентябре—октябре. Признаком зрелых спорокарпов является легкое выделение из них покоящихся спор, характеризующихся ясно выраженной двуслойной оболочкой: бесцветной наружной и желтоокрашенной внутренней.
Вторым условием успешной культуры эндогонов является отбор здоровых спорокарпов, не зараженных паразитическими грибами, которые нередко поражают споры грибов из семейства Endogonaceae (Thaxter, 1922; Mosse, 1954, 1959; Godfrey, 1956, 1957в; и др.).
Третьим важным условием является поверхностная дезинфекция спор, проводимая обычно» хлорамиром — Т (в концентрации 200 частей на миллион) в течение 15 минут (с добавлением стрептомицина и детергента).
Однако и соблюдение перечисленных условий еще не гарантирует успешного прорастания спор эндогоновых грибов: необходима дополнительная стимуляция этого процесса.
Для стимуляции прорастания спор исследователями применялось много различных приемов и способов, описанных в работах Gerdemann (1955, 1968), Gilmore (1968), Godfrey (1957) и др., но наибольшего успеха в этом отношении добилась Mosse (1959). По ее мнению, лучше всего прорастание спор стимулировать следующим образом. В стерильную чашку Петри помещается металлическое или стеклянное кольцо. В пространство между стенками чашки Петри и кольцом вливается 0,75%-ный водный агар, а в центр — почво-агаровая среда (0,2 г просеянной почвы и 0,5 мл 0,75%-ного водного агара). После затвердения агара кольцо удаляется, а на агар кладется большой стерильный целлофановый диск, на который помещаются маленькие также дезинфицированные целлофановые квадратики со спорами. Споры, расположенные на целлофане, диффузно получают из почвы необходимые для прорастания стимулирующие вещества, вместе с тем до мйнимума сводится их заражение патогенными микроорганизмами. При инкубации (20° С) через 2—4 дня прорастает 80—100% спор эндогоновых грибов.
В культуре у эндогоновых грибов наблюдается тенденция к образованию мицелия двух типов: воздушного на целлофане и Погруженного в почво-агаровую среду.
Это явление, видимо, отражает условия естественного роста эндогоновых грибов, живущих частично в почве, частично в корнях высших растений.
Для успешного культивирования эндогоновых грибов важно знать потребности роста и условия синтеза везикулярно-арбускулярных микориз. Mosse (1959), основываясь на предположении, что везикулярно-арбускулярный эндофит является облигатным симбионтом, который не может быть выращен в отсутствии корней растения-хозяина, провела серию опытов, чтобы установить, насколько рост эндогоновых грибов может быть стимулирован либо путем асептического выращивания сеянцев на агаре с помещенными около корней спорами, либо прибавлением в среду корневых вытяжек. Ею выяснено, что в асептических условиях непосредственный контакт с корнями не ускоряет роста гиф или ускоряет его кратковременно. Если срезанные корешки на 5—8 минут поместить в звуковой дезинтегратор, то полученная суспензия увеличивает рост гиф на водном агаре. Дезинтегрированная таким же способом культура хлореллы оказала большее положительное воздействие, чем корни высших растений. По-видимому, концентрация ростактивирующих веществ в хлорелле выше, чем в корнях. Органические кислоты (яблочная, уксусная, лимонная, пировиноградная, виннокаменная) увеличивают прирост мицелия. Вероятно, они могут использоваться грибом как источник углерода.
Можно ли в асептических условиях вызвать образование везикулярно-арбускулярных микориз с помощью мицелия, полученного из проросших спор? Такие опыты проделала Mosse (1962). Ей удалось искусственно заразить асепти — ческй выращенные сеянцы нескольких растений: пшеницы, ежи сборной, огурцов, лука, четырех видов клевера. Для искусственного синтеза микориз, по мнению Mosse, необходимо 2 условия: во-первых, присутствие сопутствующих бактерий, например Pseudomonas marginalis, во-вторых, низкое содержание азота в питательной среде. Дают положительный эффект и культуральные фильтраты бактерий и некоторые протеолитические (трипсин, пепсин), целлюлозо-разрушающие и пектинолитические ферменты, а также этилендиаминтетрауксусная кислота.
Для экспериментальной работы с фикодоицетными эндомикоризами исследователю очень важно всегда иметь под руками достаточное количество инокулюма для искусственного заражения опытных растений эндогоновыми грибами. Такие возможности открывает перед учеными разработанный Джильмором (Gilmore, 1968) и усовершенствованный Гердеманном (Gerdemann, 1968) метод так называемых открытый горшечных культур («open pot cultures»). Его сущность заключается в том, что растения, выращенные в открытых горшках со стерильной почво-песчаной смесью, заражаются хламидоспорами эндогоновых грибов, извлеченных одним из выше описанных способов. Полученные этим методом эндомикоризные растения культивируются в оранжерее. За летний сезон на растениях с искусственно синтезированными эндомикоризами происходит накопление спор определенного вида эндогоновых грибов, которые затем можно использовать в эксперименте в качестве инокулюма. Гердеманн предложил заражать растения эндогоновыми грибами не в горшках, а в воронках, наполненных стерильной почвенно-песчаной смесью. Инокулюм и поверхностно стерилизованные семена в этом случае рекомендуется помещать в горлышко воронки. Такое размещение хламидоспор эндогоновых грибов, по Гердеманну, гарантирует их прорастание и быстрый синтез эндомикориз.
Благодаря применению перечисленных выше методов стало возможным синтезировать везикулярно-арбускулярные эндомикоризы, а это открывает большие возможности для изучения их физиологического значения в жизни высшего растения.