С целью изучения сроков образования L-форм бруцелл в организме овец нами проведен ряд исследований, сущность которых заключается в следующем.
Беременной овце была введена внутривенно культура штамма К-48 в дозе 60 млрд. микробных тел. Через 4 мес после заражения овца была убита для бактериологического обследования.
В культурах 1-й генерации, в особенности из плода овцы, обнаружены образования, сходные со сферопластами, L-формами и другими формообразованиями. Имелась аггрегация клеточного (исходных клеток) детрита в виде огромных неровных скоплений, в которых заметно формирование, по-видимому, L-форм (протопластов), а также гигантских шаров.
В первой культуре бактерий, выделенных из плода, видна типичная динамика формообразования сферических тел, т. е. распад исходных клеток. Он характеризуется, с одной стороны, скоплением клеточного вещества, выпавшего и различные по величине формы, с другим процессом формирования микробов с довольно отчетливой оболочкой, потенциально способных к культивированию.
Для выявления быстроты образования L-форм бруцелл в организме восприимчивых животных брали 5 молодых баранов (в 8—10- мссячном возрасте), двум из которых подкожно вводили вирулентную культуру Br. melitensis штамма № 590, 2 — вакционный штамм № 19 и 1 — невирулентную культуру Br. melitensis неагглютинабельного штамма R-110. Дозы культур были взяты разные. Вирулентную двухсуточную культуру Br. melitensis штамма № 590 вводили подкожно в дозе 100 тыс. микробных тел. Обе другие культуры штаммов № 19 nR-110 вводили тоже подкожно, но по 60 млрд. микробных тел. Кровь для выделения культур бруцелл, в том числе и L-форм, брали на 5, 10, 15-й день и в более поздние сроки после обработки животных. Опыт продолжался один год.
Выделение S-форм Br. melitensis было установлено только у одного барана (№ 38), зараженного штаммом № 590, и только в первое исследование через 5 дней после заражения. Во все последующие исследования типичные бруцеллы в S-форме не выделялись из крови барана. Однако при каждом исследовании у всех 5 баранов выделялись L-формы бруцелл. Они по морфологии отличались от тех форм, которые ранее получены нами в эксперименте на питательных средах. Это были преимущественно тонкие, длиной 1—3 мкм, а иногда и более палочковидные грамотрицательные формы. На питательных же средах, как это показано выше, L-формы бруцелл часто воспроизводились в виде сферопластов.
При анализе антигенной характеристики указанных L-форм бруцелл обнаружена непредвиденная закономерность.
Эта закономерность состояла в том, что в крови животных в первый период бруцеллезной инфекции, вызванной L-формой бруцелл, обнаруживаются лишь следы L-антнтел и то не у всех животных, тогда как антигены, полученные из культур L-формы бруцелл, выделенные от этих же животных, обладали выраженным напряжением иммунологической активности с широкой амплитудой, охватывающей особенности О-антигена Br. ovis, О-антигена Br. abortus и Br. melitensis и частично, S-антигена бруцелл. Эта особенность, по-видимому, объясняется тем, что выделенные культуры из организма животных, из которых может быть получен антиген для РДСК, становятся более жизнеспособными по сравнению с теми, которые остаются в инфицированном организме. Тем более, что от времени выделения культуры до ее стабилизации проходит несколько недель или месяцев, прежде чем из нее удается получить массу бактерий на плотной среде, необходимую для приготовления антигена для РДСК.
Идентификацию L-форм бруцелл, полученных лабораторным путем, с культурой, выделенной из организма баранов, производили путем сравнения их антигенной структуры. Наиболее удобно получать L-форму бруцелл из штаммов, находящихся в МВБ-форме. В процессе получения L-формы бруцелл исходные (контрольные) штаммы не вводили каким-либо подопытным животным.
Культура бруцелл в L-форме, полученная на питательных средах из исходной культуры Br. abortus, обозначается везде под № 249, а из исходной культуры Br. melitensis — под № 6.
Для получения L-антигена бруцелл L-культуру двухсуточного роста засевали на твердую питательную среду, приготовленную по следующей прописи: отвара мышцы сердца крупного рогатого скота — 1000 мл; пептона— 1%; NaCl (химически чистого) — 0,5%; агар-агара— 2%; сахарозы—2%. Конечная pH 7,6.
Перед использованием вводили в среду сыворотку крови крупного рогатого скота из расчета 20% для твердой и 30% для полужидкой среды. Эту же среду использовали для всех посевов с целью получения культур L-формы бруцелл (гемокультуры, абортированные плоды, экспериментальные животные, убитые или павшие).
Матрасы после двух-трехсуточного роста в термостате при 37,5° С просматривали на чистоту роста. Они должны отвечать требованиям типичной микроскопической картины L-форм бруцелл без примеси посторонней микрофлоры. При отсутствии посторонней микрофлоры чистые культуры L-бактерий смывали и изготавливали из них антиген по методике, описанной выше.
Наиболее часто культура бруцелл в виде реверсивных L-форм имеет следующую микроскопическую картину: комкование и агрегация микробных клеток в состоянии полного или частичного распада, откуда формируются первичные протопласты, в различных образованиях обнаруживаются свободная протоплазма и неокрашивающиеся по Граму клетки, у которых видна только оболочка.
Эти «пустотелые» формы часто бывают округло-овальной формы с окрашенными в темный цвет полюсами. Встречаются также продолговатые формы со вздутыми концами, палочковидные разной величины, их тени или чехлы. В комьях клеточного детрита формируются грамотрицательные клетки, из которых в дальнейшем могут образоваться устойчивые формы, способные к длительному переживанию на питательных средах. Эти клетки морфологически могут быть неоднородны. Иногда из них формируются грамположительные или грамотрицательные сферопласты, характерной чертой которых в этом периоде является более светлая зона (просвет) в середине клетки. Иногда в процессе восстановления клеток половина сферы остается пустой, а вторая половина по ободку оболочки приобретает резко выраженную основу, как правило, неокрашивающуюся по Граму. Получается вид полукольца. Стабильные реверсивные формы бруцелл чаще имеют округлую или округло-овальную, а также кокковидную формы, клетки в них располагаются одиночно и парно. Реже встречаются палочковидные и нитевидные формы (последние чаще обнаруживаются в культурах Br. suis и Br. melitensis). Как видно из изложенного, в отношении морфологии бруцелл могут быть самые различные нюансы, в особенности в начале L-формообразования. Стабильные реверсивные клетки L-формы бруцелл встречаются более однородными морфологически. Эти формы (РВБ) сравнительно быстро восстанавливают О-антиген бруцелл, а некоторые и S-антиген.
Исходя из изложенного, следует, что наиболее достоверным методом идентификации L-форм является метод сравнительного сопоставления их антигенов с известными антигенами бруцелл.
Всего было бактериологически обследовано на бруцеллез и бактериоз, вызванный L-формой бруцелл, 286 овец и 145 абортированных плодов. При этом было выделено от овец всего 130 культур, из них 2 культуры представляли собой типичных бруцелл, а 128 отнесены нами к L-формам. Из абортированных плодов выделено типичных культур бруцелл 15, а отнесенных к L-формам — 24. Эти исследования побудили пас провести более широкие серологические и бактериологические обследования овец и баранов из различных отар по отношению их к L-бруцеллезной инфекции.
Для уточнения условий возникновения L-антител в отарах, неблагополучных по бруцеллезу, нами были обследованы сыворотки крови двух групп овец из острого очага бруцеллеза.
В первой группе было 10 сывороток крови от овец, положительно реагировавших на бруцеллез по РА и РДСК, во второй также 10 от овец той же самой отары, но не реагировавших на бруцеллез по РДСК с теми же антигенами. Обследование проведено одновременно с S (стандартным)-, OS — и О-антигенами бруцелл, антигеном Br. ovis, антигеном, полученным из L-форм бруцелл (№ 279) и с 2 антигенами а и б, изготовленными из L-форм бруцелл, выделенных от 2 человек, больных хроническим L-бруцеллезным бактериозом. Антиген 279 получен из лабораторных штаммов, типичных бруцелл, не проводившихся через организм каких-либо животных.
В одном очаге бруцеллеза в одной и той же отаре имеется 2 формы инфекционного бруцеллезного процесса. Первая форма — это типический бруцеллез с выраженными положительными реакциями, главным образом на поверхностно-оболочечный антиген (стандартный антиген для РСК и РДСК изготовляется из двух штаммов Br. abortus и одного штамма Br. suis). Вторая форма инфекционного процесса, противоположная первой, обусловливается за счет L-форм бруцелл. Причем L-антитела наиболее выражены у тех овец, у которых еще нет бруцеллезной типической инфекции. Следовательно, L-бруцеллезный бактериоз распространяется в неблагополучных по данному заболеванию отарах овец как самостоятельная инфекция, притом очень быстро с большим охватом животных.
Чтобы уточнить, какая из этих форм инфекционного процесса является первичной в неблагополучных отарах, нами были обследованы ягнята — баранчики в 6—8-месячном возрасте, родившиеся от овец в неблагополучной по бруцеллезу отаре.
Результаты этих исследований показали, что бруцеллезная инфекция у баранчиков начинается с L-бруцеллезного бактериоза. При этом установлено, что гемокультура L-форм бруцелл обнаружена и крови тех ягнят, у которых никаких антител не было Г 2297) или они были в зачаточном состоянии (№ 2068). У ягнят, которых L-бруцеллезные антитела были выражены наиболее ярко № В3121 и 0160), появились следы О-антигена бруцелл; по-видимому, эти антитела можно считать признаком реверсии L-форм бруцелл.
Проведенные исследования сыворотки крови овец в отаре, неблагополучной по бруцеллезу, прививавшейся вакциной из штамма № 19, показали, что у этих животных особенно высоко напряжение L-антител при незначительном проявлении S-антител у отдельных животных.
Высокое напряжение L-антител в крови овец, привитых вакциной из штамма № 19, указывает на связь их с этой вакциной. В какой-то степени этим объясняется наиболее выраженный результат, полученный в РДСК с L-антигеном 279 бычьего происхождения.
Наши исследования благополучной и неблагополучной по бруцеллезу группы овец показали, что в начале бруцеллезной инфекции у овец, не привитых против этого заболевания какой-либо вакциной. Антитела обнаруживаются в небольшом количестве и преимущественно у тех овец, у которых были выявлены S-антитела по РДСК. Возможно предположить, что здесь первичная инфекция возникает у животных, не имевших в своем организме бруцелл в измененной L-форме.
L-антитела у этих животных обнаружены главным образом с L-антигеном, изготовленным из овечьего штамма № 6 и частично из человеческого штамма а. Очень активный L-антиген 279, изготовленный из бычьего штамма L-формы бруцелл, не проявил никакого иммунного родства к спонтанным L-антителам овечьего происхождения. В данном случае вырисовывается некоторая видовая специфичность L-бруцеллезных антител, а, следовательно, и антигенов.
В крови здоровых племенных баранов (группа № 2) никаких антител обнаружено не было. Все животные обеих групп обследованы на наличие в периферической крови L-форм бруцелл. При этом субкультуры получены только от первых четырех овец (№ 8475, 7827, 8404 и 3116). Микроорганизмов, устойчивых на питательных средах, у остальных животных не выделено.