Пэрл выступал против тех, кто рассматривал старение как результат изменений на клеточном и субклеточном уровнях.
Он полагал, что снижение функциональной активности — это следствие той взаимозависимости, которая существует между клетками многоклеточного организма, своего рода «расплата» за преимущества, связанные со специализацией клеток. Тем не менее многие продолжают придерживаться того мнения, что старение организмов, по существу, представляет собой результат изменения клеток, из которых состоит организм, а не следствие нарушения их функциональной и структурной взаимосвязи. Согласно этому мнению, старение — это результат процессов, протекающих на клеточном уровне, а не на уровне тканей, систем органов и организма в целом.
Хотя надо считать твердо установленным, что эта последняя точка зрения ближе к истине, чем многие другие взгляды Пэрла, необходимо всегда помнить, что изменения, происходящие на клеточном уровне, могут быть следствием дезорганизации на надклеточном уровне, а не ее причиной. В качестве рабочей гипотезы мы принимаем допущение о том, что в процессе старения участвуют субклеточные и надклеточные факторы. Однако доминирующие и необратимые аспекты отвлекают наше внимание от изменений на клеточном уровне.
Клетки относятся к довольно простым биологическим системам. В поисках возрастных изменений достаточно исследовать не более полудюжины различных структур, а именно: 1) мембраны (клеточную и ядерную); 2) митохондрии, обеспечивающие накопление энергии в процессе окислительного фосфорилирования; 3) эндоплазматический ретикулум — система, компоненты которой после гомогенизации входят в состав микросомной фракции; 4) ядро — морфологическое образование, воз1растные изменения которого могут касаться не только генетического аппарата, но и присущих ядру обменных функций; 5) аппарат Гольджи, существование которого еще 10 лет назад подвергалось сомнению и было окончательно признано лишь после специальных исследований с применением интерференционного и электронного микроскопа, выявивших наличие телец определенной структуры, формы и расположения (о возрастных изменениях аппарата Гольджи известно еще очень мало); 6) наконец, различные гранулы, вакуоли или включения, вроде пиноцитозных вакуолей, лизосом и гранул липофусцина.
Митохондрии
Отчетливым показателем возрастных изменений активности митохондрий или их общей массы в ткани может служить интенсивность дыхания гомогенатов или срезов в присутствии специфических субстратов или акцепторов. Уровень активности митохондрий в целом организме, несомненно, зависит от ряда факторов, среди которых наиболее важным надо считать наличие акцепторов фосфатов и соответствующих субстратов. Следовательно, на интенсивность дыхания гомогенатов и срезов тканей должны влиять многочисленные реакции, связанные с дефосфорилированием АТФ (аденозинтрифосфат).
Рейнер изучал влияние возраста на углеводный обмен гомогенатов тканей крысы и обнаружил снижение потребления кислорода мозгом лишь в возрасте старше 2 лет. Он наблюдал также постепенное снижение интенсивности анаэробного гликолиза. Рейнер ставил свои опыты с избытком субстратов. Рафский и др. изучали возрастные изменения дыхания гомогенатов на тканях морской свинки. Эти авторы измеряли потребление кислорода в присутствии глюкозы и раствора Рингера. В опытах с гомогенатами печени, взятой у животных различного возраста (от 8 до 100 недель), существенных возрастных изменений не наблюдалось; на гомогенатах почки удалось выявить довольно существенные возрастные различия.
В одной из недавно опубликованных работ Бэрроуз и сотр. определяли интенсивность потребления кислорода и анаэробного гликолиза в срезах почки и печени у крыс различного возраста (12—14 и 24—27 месяцев). Потребление кислорода срезами почки при расчете на сырой вес (а не на ДНК) у старых крыс было ниже, чем у молодых. В опытах со срезами печени подобных различий не отмечали.
Отсутствие возрастных изменений дыхательной активности было подтверждено в опытах по измерению содержания сукцинатоксидазы в гомогенатах печени. Было выявлено небольшое, но статистически значимое снижение активности этого фермента (в расчете на ДНК), в ткани почек и сердца (но не в печени).
Бэрроуз и сотр. определяли содержание сукцинатоксидазы в митохондриях из ткани почки молодых и старых животных, но не выявили возрастных изменений активности этого фермента (в расчете на 1 мг белкового азота). Поэтому снижение активности этого фермента в неочищенном гохмогенате следует считать следствием уменьшения числа митохондрий, а не изменения относительного количества фермента в каждой митохондрии.
В 1956 г. Демпси попытался сопоставить морфологические изменения митохондрий с возрастом. В тканях старых животных наблюдались дегенеративные формы митохондрий. Однако оценка этих данных сопряжена с большими трудностями из-за невозможности проследить за жизненным циклом отдельной митохондрии. Эндрью пишет:
«В клетках молодых мышей можно видеть множество митохондрий; некоторые из них имеют вид нитей, но совершенно нет митохондрий типа крупных гранул. В клетках же старых мышей многие митохондрии имеют вид гранул. Местами они образуют небольшие скопления пли цепочки, а часто лежат по одиночке. Подобная картина наблюдалась также в клетках Пуркинье (в мозжечке); следовательно, возрастные изменения в содержании митохондрий наблюдаются даже в таких клетках, как нейроны».
Следует, однако, отметить, что митохондрии чрезвычайно чувствительны к изменениям среды. Палад и Шидловский подметили связь жировых включений с митохондриями. Форма митохондрий изменяется (правда, обратимо) при кратковременном воздействии высоких и низких температур. Вполне возможно поэтому, что упомянутые выше изменения связаны не со старением самих митохондрий, а с тем, что под влиянием условий среды они выглядят в старых клетках не так, как в молодых. Показателем нарушения функциональной активности митохондрий при неблагоприятных условиях (в том числе при старении) может служить изменение отношения Р/О. Вейнбах наблюдал уменьшение отношения P/О у улиток с 1,3 в возрасте 2 недель до 0,5 в возрасте 12 недель. В своих первых опытах Вейнбах использовал в качестве субстрата α-кетоглутаровую кислоту. Он показал, что с возрастом активность аденозинтрифосфатазы увеличивалась в 2—3 раза и что это сопровождалось уменьшением реакции на ингибитор — пентахлорфенол. Нельзя с уверенностью сказать, отражают ли эти различия истинные изменения митохондрий в процессе старения или же они связаны с изменением чувствительности митохондрий к различным воздействиям, применяемым при их выделении из тканей. В более поздних работах Вейнбах, а также Вейнбах и Гарбус сообщили о некоторых различиях. между митохондриями, выделенными из тканей молодых и старых животных. Работая с митохондриями, выделенными из ткани печени, и используя в качестве субстрата р-оксимасляную кислоту, эти авторы показали, что функциональная активность митохондрий (выраженная в микромолях фосфата на 1 мг азота) снижалась с 16,8 в опытах на молодых животных (в возрасте 3 месяца) до 11,8 у старых животных (в возрасте 24—37 месяцев). При этом наблюдалось пропорциональное уменьшение количества образованного ацетоацетата или поглощенного β-оксибутирата, так что отношение этерифицированиого фосфата к окисленному субстрату оставалось постоянным (2,8). Вместе с тем интенсивность гликолитического фосфорилирования в печени почти не изменялась. В опытах с гомогенатами ткани мозга молодых (3 месяца) и старых (30 месяцев) животных при использовании в качестве субстрата янтарной кислоты не было отмечено возрастных изменений в интенсивности фосфорилирования и поглощения кислорода. Итак, Вейнбах показал, что при использовании таких субстратов, как α-кетоглутарат и яблочная и янтарная кислоты, возрастные различия интенсивности фосфорилирования и отношения P/О были незначительны. Если же субстратом служила β-оксимасляная кислота, интенсивность фосфорилирования снижалась до 60% исходной, хотя отношение Р/О при этом не менялось. Вместе с тем было показано, что митохондрии, выделенные из тканей старых животных при хранении в условиях низкой температуры (4°), повреждаются через 48—72 час (отношение P/О при этом снижалось); митохондрии из тканей молодых животных при таком воздействии не изменялись.
В недавно опубликованных работах Санади и Флетчера мы сталкиваемся с совершенно новым подходом к проблеме старения митохондрий. Они вводили в митохондрии крыс радиоактивную метку — ацетат, серу или железо — и через различные промежутки времени выделяли липиды и цитохром с. Интенсивность обновления компонентов митохондрий при всех трех типах меток оказалась одинаковой; период полусуществования составил всего 12 дней. Если исключить маловероятную возможность существования небольшого числа клеток с очень высокой скоростью обновления (в этом случае полученные данные характеризовали бы не всю массу митохондрий, а лишь небольшую их долю), можно признать, что столь быстрое обновление способно предотвратить разрушительные изменения, которые наблюдались бы в необновляющихся клетках.
Ядра
Майнот в своей работе «Проблема возраста, роста и смерти» выдвинул в качестве основного положения мысль о том, что естественная смерть представляет собой результат клеточной дифференцировки, важным показателем которой может служить изменение ядерно-плазменного отношения. Он полагал, что «омоложение» ткани сопровождается увеличением относительных размеров ядра, а старение — увеличением массы протоплазмы по отношению к ядру и клеточной дифференцировкой. Сам Майнот не привел достаточно обоснованных доказательств в подтверждение этого положения, да и в последующие годы не были накоплены соответствующие факты. Смолвуд и Филлипс определяли размер ядер в клетках пчел на протяжении их жизненного цикла. Существенного влияния возраста на размер ядра не отмечено. Применение современных методов исследования, в частности радиоавтографии, позволит более строго подойти к оценке данной гипотезы.
Фалыконе и др. недавно провели работу с целью изучить влияние возраста на плоидность ядер крысиной печени путем определения их объема и среднего содержания ДНК. Существенных возрастных изменений не обнаружено, хотя Эндрью отмечал отдельные аномальные кариотипы. Мы уже указывали на более высокую частоту амитоза. В тканях, подвергающихся атрофии, пикноз и кариолиз нередко сопровождают процесс отмирания клеток. Однако, по мнению автора, многие изменения формы ядра являются побочным результатом нарушений на тканевом уровне, а не отражением процесса старения, свойственного самим клеткам.
Имеется, однако, несколько групп данных, позволяющих предполагать существование особых аномалий ядра, которые чаще встречаются у старых животных. К таким аномалиям прежде всего относится анеуплоидия соматических клеток, которая, по данным Хею и Померата, проводивших свои исследования на собаках, морских свинках и крысах, чаще встречается в тканях животных старших возрастных групп. Высокую частоту анеуплоидии соматических клеток у китайского хомячка отметил Ерганьян. У этого животного имеется 22 хромосомы,, каждая из которых может быть точно идентифицирована. Частота анеуплоидии у этого животного достигает порой 40—60%. Существование аномального кариотипа зародышевых клеток показали Джекобе и др. на примере случая болезни Дауна. Эта генетически обусловленная болезнь связана с присутствием небольшой добавочной ацентрической хромосомы, которая появляется, по-видимому, в результате неравномерного редукционного деления; точно так же и анеуплоидия соматических клеток может возникать как следствие ошибок в расхождении хромосом при митозе. Хотя до сих пор не было проведено систематических исследований зависимости соматической анеуплоидии от возраста, Кертис (личное сообщение) собрал некоторые данные, касающиеся появления аномалий кариотипа в процессе старения и повышения их частоты при действии ионизирующего излучения. Непосредственное отношение к этому вопросу имеют данные Пенроза, установившего зависимость частоты болезни Дауна от возраста матери к моменту рождения больного ребенка.
Вряд ли можно приписать 100-кратное увеличение частоты болезни Дауна влиянию одного лишь времени, так как в течение первых 15 лет (15—29) этот показатель не меняется, а за последующие 15—20 лет увеличивается в 100 раз. Возможно, это объясняется изменением характера среды, в которой происходит развитие яйца. Возможно также, что в первые годы детородного периода у женщин образуются нормальные яйцеклетки, а по мере того как запас жизнеспособных яйцеклеток истощается, все чаще появляются патологически измененные. Тот факт, что частота болезни Дауна совершенно не зависит от возраста отца, свидетельствует о значении возраста яйцеклетки.
Микросомы, эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи
О возрастных изменениях микросом и эндоплазматического ретикулума свидетельствуют данные об уменьшении с возрастом содержания вещества Ниссля в нервной ткани животных и человека. По данным Пеляи и Палада тельца Ниссля представляют собой не что иное, как содержащие РНК гранулы эндоплазматического ретикулума. В той же работе авторы указывают, что им не удалось идентифицировать аппарат Гольджи, но они склонны принять за него лежащую вблизи ядра часть гладкого эндоплазматического ретикулума, компоненты которого отличаются более плотной «упаковкой». Это предположение согласуется с полученными при помощи фазово-контрастной микроскопии данными Гетенби о расположении этой структуры в симпатических ганглиях мыши. Выше мы привели данные Эндрью о наблюдавшихся им изменениях аппарата Гольджи в нервных клетках старых мышей. Характерная для этой структуры непрерывная сеть превращается в отдельные разбросанные в беспорядке гранулы. Есть основания ожидать, что исследование возрастных изменений аппарата Гольджи при помощи электронного микроскопа значительно расширит наши представления. Сейчас трудно решить, связаны ли возрастные изменения аппарата Гольджи и эндоплазматического ретикулума (подобно возрастным изменениям митохондрий) с характерными для старения изменениями в тканях или они возникают в результате каких-то глубоких внутриклеточных изменений. В пользу первого предположения свидетельствует наличие множества на первый взгляд нормальных клеток в организме «нормальных» старых животных. Поскольку эндоплазматический ретикулум, несомненно, принимает участие в процессах синтеза, частичная его потеря сводится к снижению функциональной активности клетки; а быть может, наоборот, эта потеря является результатом снижения потребности клетки в синтезе в процессе старения.
Ядерная и клеточная мембраны
Данные о возрастных изменениях ядерной и клеточной мембран весьма скудны, если не считать работ Лансинга о накоплении кальция в кортикальном слое клеток. Вполне вероятно, что ядерные и клеточные мембраны непрерывно обновляются. Об этом свидетельствуют результаты киносъемки клеток в культуре, которые дают представление о подвижности мембран в процессе фагоцитоза и пиноцитоза. Мы не располагаем достоверными данными о скорости диффузии через мембраны клеток, если не считать данных Кирка и Ларсена о проницаемости клеток мозжечка и аорты у людей различного возраста; этим авторам не удалось выявить существенные возрастные различия. Необходимо провести более точные исследования скорости диффузии в различных тканях интактных животных различного возраста.
Накопление пигмента и лизосомы
Еще в начале века было установлено, что в некоторых неделящихся клетках, таких, например, как нервные и мышечные, нередко накапливаются пигментные включения. Гамперл, который провел систематическое исследование распределения таких пигментов и обычно сопровождающей их флуоресценции, показал, что такие флуоресцирующие вещества встречаются в самых разнообразных клетках. Несколькими годами позднее Бете и Флюк, изучавшие желтый пигмент ганглиозных клеток, показали, что липофусцин и его предшественники легко отличимы от вещества Ниссля — вещество, окрашенное по Нисслю, исчезает при обработке щелочью, а липофусцин, окрашенный толуидиновым синим, при этом сохраняется. В 1950 г. Хиден и Линдстром провели ряд остроумных биофизических исследований желтого пигмента нервных клеток. Они исследовали при помощи микроспектрофотометра спектры излучения и поглощения этого пигмента. В спектре поглощения имеется перегиб примерно при 3700 Å. Спектр излучения характеризовался двумя максимумами при 440—460 и при 530—560 мμ. На основании спектрального анализа было решено, что желтый пигмент представляет собой производное птеридина; однако это не было подтверждено последующими работами. Гатенби высказал предположение, что так называемый «пигмент старения» в клетках автономной нервной системы человека на самом деле представляет собой гранулы секрета; при этом он ссылался на то, что эти гранулы непосредственно связаны с аппаратом Гольджи. Неизвестно, имеет ли эта связь функциональное значение или она носит случайный чисто морфологический характер.
Дин и Фоусетт наблюдали в яичниках старых мышей признаки так называемой бурой дегенерации — накопление пигмента в интерстициальных клетках. Хотя авторы не называют этот пигмент липофусцином, они указывают, что он нерастворим в ацетоне, флуоресцирует, ШИК-отрицателен, но становится ШИК-положительным после обработки перманганатом. Яичники этих животных продолжали функционировать.
На основании данных электронной микроскопии Гесс выдвинул новое предположение о происхождении пигментных телец в спинальных ганглиях старых животных. Он считает, что эти тельца представляют собой продукт дегенерации митохондрий. Из соображений, которые будут приведены ниже, эта мысль представляется не вполне убедительной. Соса предполагает, что внутриклеточные нейрофибриллы конденсируются в процессе старения и, агглютинируясь, превращаются в пигментные гранулы. Этот же автор высказал мнение, что отложение пигмента является характерной чертой дегенерации нейронов.
Гистохимической характеристике отложений липофусцина в нервной системе старых собак посвящено несколько работ Салкина. Он наблюдал накопление ШИК-положительного вещества; поскольку реакция ШИК выявляет наличие смежных гидроксильных групп, данные о накоплении ШИК-положительного вещества можно интерпретировать двояко: либо как результат накопления с возрастом каких-то продуктов распада углеводов, либо, как предположил Пирс, как накопление промежуточных продуктов самоокисления липидов; второе предположение более вероятно. Салкин и Кунтц обнаружили в пигментных гранулах щелочную фосфатазу. Они наблюдали также исчезновение так называемой хромидиальной субстанции и изменение аппарата Гольджи у собак по мере старения. Не зная всех деталей этих исследований, трудно дать правильную оценку приведенных фактов.
В 1955 г. Салкин продолжил свои исследования, касающиеся накопления ШИК-положительного вещества, и указал на накопление липофусцина по мере старения. Совсем недавно он высказал сомнение в том, что накопление липофусцина является неотъемлемым компонентом процесса старения, и предположил, что оно связано с различными внешними воздействиями (в том числе с травмой). Основанием для такого предположения послужили результаты опытов на крысах, у которых, несмотря на молодой возраст, различные виды стресса — инъекция кортизона, пребывание в атмосфере с низким парциальным давлением кислорода, скрамливание ацетанилида — сопровождались накоплением липофусцина. Рассуждая логически, вряд ли можно считать эти наблюдения основанием для отрицания интимной связи накопления пигментов с процессом старения. Любой процесс, ускоряющий их накопление, может идти своим собственным путем.
Джейн изучал на трупах накопление липофусцина в сердечной мышце людей различного возраста, а также свойства малорастворимых частиц, полученных из тканей, содержащих много липофусцина. Описанные им частицы нерастворимы в различных органических и неорганических растворителях (даже в сильных кислотах). Позже Гейденрейх и Зиберт выделили гранулы липофусцина из сердечной мышцы при помощи центрифугирования без предварительной обработки ферментами. Они определяли содержание в них липидов и обнаружили в гранулах эстеразу и протеазу (катепсин?). Бондарев в 1957 г. опубликовал данные электронной микроскопии, касающиеся содержания липофусцина в спинальных ганглиях старых крыс. В отличие от Гесса, он не считает, что пигмент является продуктом дегенерации митохондрий, а полагает, как и Гатенби, что он каким-то образом связан с аппаратом Гольджи. Свои взгляды на функцию и происхождение пигментов нервной системы Бондарев сформулировал в обзоре, опубликованном в «Handbook of Aging of the Individual». В двух гистохимических исследованиях, из которых одно провели Гедиг и Бонтке, а другое — Эсснер и Новиков, приводятся данные о связи липофусцина, накапливающегося в ряде тканей, со своеобразными частицами, описанными недавно Де Дювом и его сотрудниками. Речь идет о лизосомах. Пигмент, выделенный Гедичем и Бонтке, окрашивался подобно липофусцину и содержал эстеразу и кислую фосфатазу. Те же ферменты, как правило, обнаруживаются и в частицах, выделенных Де Дювом из печени. Эти же авторы обнаружили корреляцию в распределении пигмента и кислой фосфатазы в сердечной и скелетной мышцах; в тканях печени, семенников и надпочечников подобной полной корреляции установить не удалось. В печени появление кислой фосфатазы предшествует появлению гранул липофусцина. В самое последнее время были получены данные о колебаниях содержания липофусцина в печени при различных патологических состояниях. Кислая фосфатаза была обнаружена также в клетках, где наблюдалось отложение другого пигмента — цероида.
Эсснер и Новиков исследовали с помощью обычного и электронного микроскопа лизосомы из печени человека и независимо друг от друга установили корреляцию в расположении пигментных включений и ферментов. Всем, кто глубже интересуется этим вопросом, мы рекомендуем ознакомиться с указанными работами.
В 1957 г. Стрелер и др. опубликовали результаты количественного определения объема, занимаемого гранулами липофусцина в миокарде у людей разного возраста. Они показали, что количество пигмента увеличивается с возрастом линейно и что скорость накопления составляет 0,3% общего объема сердца и примерно 0,6% внутриклеточного объема за 10 лет. Таким образом, у лиц в возрасте 90 лет 6—7% общего объема клеток оказывается заполненным пигментом. Скорость накопления пигмента не зависит от расы и пола. Однако недавно были опубликованы следующие интересные данные: у японцев, переживших взрыв атомной бомбы в Хиросиме, скорость накопления пигмента в миокарде вдвое выше, чем наблюдаемая у американцев. При сопоставлении двух групп японцев обнаружить какой-либо разницы между ними не удалось.
Стрелер и сотр. предприняли детальное исследование химического состава гранул липофусцина, выделенного из миокарда человека методом дифференциального центрифугирования. Была обнаружена активность катепсина и кислой фосфатазы. Вопреки ожиданию, оказалось, что основное флуоресцирующее вещество пигментных гранул растворяется в смеси хлороформа с метиловым спиртом. Хроматография этого вещества на колонке из кремневой кислоты выявила присутствие веществ, сходных с продуктами самоокисления кефалина, а также других ненасыщенных жиров. Хотя почти все флуоресцирующее вещество извлекается органическими растворителями, в нерастворимом остатке сохраняется значительное количество бурого пигмента, возможно, содержащего иные хромофорные группы. В настоящее время проводится изучение их химической природы, а также аминокислотного состава входящего в них белка.
Все сказанное выше с большой долей вероятности свидетельствует о том, что липофусцин образуется в результате накопления и самоокисления липидных компонентов лизосом. Сейчас трудно сказать, сохраняется ли при этом исходная активность лизосом и происходит ли непрерывное постепенное их накопление в неделящихся клетках. Вполне возможно, что накопление пигмента является случайным побочным продуктом химического превращения лизосом. Можно предположить, что благодаря наличию особой оболочки, состоящей из кефалина или других фосфолипидов и способной противостоять литическому действию ферментов, лизосомы не подвергаются обновлению, характерному для остальных компонентов клетки. В самом деле, такое обновление было бы связано с освобождением активных литических ферментов, что при неподходящих условиях оказалось бы вредным для клетки. Поэтому у нас возникла мысль, что способность к накоплению липофусцина (какова бы ни была роль этого вещества в процессе старения) возникла как приобретенный признак при эволюционном развитии оболочки, в которую могли быть заключены литические ферменты; эта оболочка должна быть: (а) достаточно стабильной для хранения этих литических ферментов, (б) легко разрушающейся в соответствующих условиях, т. е. при включении пускового механизма резорбции (в процессе морфогенеза) или удалении поврежденных клеток и (в) одновременно достаточно стойкой к действию кислорода и других активных веществ внутриклеточной среды.