До сих пор мы говорили главным образом о том, что происходит с вирусом, попавшим в чувствительную клетку, как он размножается и производит полчища себе подобных. А теперь давайте посмотрим, что же происходит с клеткой, на которую напал вирус.
Вы, конечно, понимаете, что клетка нас интересует гораздо больше, чем вирус. Ведь из клеток строится все живое на Земле. Можно сказать, что изучение вирусов ведется главным образом потому, что они являются убийцами клеток.
Пораженные вирусом клетки изучаются всесторонне. Биохимики исследуют изменение обмена белков, нуклеиновых кислот и других компонентов клетки; цитологи смотрят, как изменяется строение клетки в процессе вирусной инфекции, генетики определяют, как меняются наследственные свойства клеток, перенесших заражение вирусами и т. д.
Для изучения пораженных вирусом клеток применяются самые разнообразные методы — от обычного микроскопического исследования до киносъемки.
Можно сразу же предположить, что клетка не остается безразличной к внедрению вируса. Нарушение обмена веществ, вызванное размножением этого болезнетворного агента, неизбежно приводит к глубоким изменениям ее функции и структуры. Характер этих изменений зависит от типа вируса, вида и состояния клеток и условий окружающей среды. В одних случаях зараженные вирусом клетки теряют способность к размножению и росту, в других — погибают и полностью распадаются, в третьих вирусы перерождают нормальные клетки в раковые и т. д.
Посмотрите на две фотографии. На первой изображена уже знакомая вам культура клеток HeLa, после двухсуточного роста при соблюдении оптимальных условий. Так выглядели клетки перед встречей с вирусом энцефаломиелита. Отметим, что в этом опыте было добавлено приблизительно по одному вирусу на клетку. А рядом фотография тех же клеток через 20 часов после контакта с вирусом. Не правда ли, печальное зрелище! Вместо активно растущих жизнедеятельных клеток — сморщенные, бесформенные останки.
Теперь проделаем несложный расчет. Известно, что каждая зараженная клетка производит на свет около 2 тысяч новых вирусов. На фотографии таких клеток 11, следовательно, эта небольшая группа и «дает жизнь» приблизительно 22 тысячам вирусов, которые способны напасть соответственно на 22 тысячи свежих клеток. Эти клетки произведут уже 44 миллиона вирусов. Настоящие полчища невидимых убийц! Следующий цикл заражения — и число вирусов возрастает до 88 миллиардов, каждый из которых способен (вернемся к нашим фотографиям) превратить цветущую клетку в безжизненный труп. Да, с вирусами шутки плохи!
А можно ли быстро узнать, что клетка больна? Существуют ли методы, позволяющие скоро и безошибочно отличить зараженную клетку от здоровой? Нет необходимости говорить о важности этой работы. Ведь чем раньше мы обнаружим вирус, тем быстрее можно принять меры для его уничтожения. Нужно сказать, что такие методы разработаны в последние годы и один из самых интересных из них так называемый метод флуоресцирующих антител. Об этом методе стоит рассказать подробнее, так как он имеет к нашей теме самое непосредственное отношение.
В ответ на введение вируса в организм животного в сыворотке этого животного появляются противотела — антитела, которые способны специфически соединяться с данным вирусом. Например, если сыворотку животного, имеющую антитела против вируса оспы, нанести на материал, содержащий вирус оспы, то специфические антитела свяжутся с вирусом. Однако это соединение нельзя увидеть.
Как же его выявить? Оказалось, что если «подвесить» к таким противовирусным антителам специальную светящуюся краску — флуорохром, то получится великолепный индикатор, четко определяющий количество и место расположения вируса в клетке.
Метод флуоресцирующих антител был применен во многих исследованиях. Он позволил не только определять присутствие вируса в клетках, которые внешне выглядели незараженными, но, что не менее важно, с помощью этого метода удалось установить место и скорость синтеза вирусного белка в клетке.
Кроме выраженной специфичности, метод люминесцирующих антител отличается высокой чувствительностью. Он был с успехом применен в различных вирусологических исследованиях. Приведем несколько примеров. Так, при изучении размножения вируса, который вызывает тяжелое заболевание пситтакоз, было обнаружено, что через 3—5 часов после заражения вирусный белок диффузно распределен в цитоплазме клеток. Через 8—12 часов обнаруживаются ярко светящиеся крупные скопления вируса.
Если внести в роговицу кролика вирус вакцины, то через 12 часов после заражения в отдельных клетках можно обнаружить вирусный белок. Он локализуется около ядерных оболочек и ярко флуоресцирует в виде отдельных зернышек. Через 18—24 часа количество вирусного белка заметно возрастает. Он обнаруживается в большинстве клеток в значительных скоплениях. Под электронным микроскопом можно увидеть, что этот вирус попадает в клетку целиком. Через час вирусная оболочка разрушается ферментом клетки, и содержимое вируса растекается; вирусные частицы исчезают. Затем образуются очаги синтеза вируса, в которых постепенно формируются полноценные вирусные частицы. Интересно подчеркнуть, что ядро клетки в размножении вируса не участвует.
Противоположную картину наблюдали при размножении вируса герпеса. При заражении культуры ткани человека этим вирусом вирусный белок выявляется вначале в ядре, где достигает больших количеств, а затем начинает проникать в цитоплазму.
С помощью флуоресцирующих антител было установлено, что синтез одних вирусов происходит главным образом в ядре (вирус герпеса, аденовирусы), других — в цитоплазме (вирусы оспы, орнитоза, пситтакоза), наконец, как мы уже говорили, у многих вирусов детали (грипп, чума кур и др.) образуются одновременно и в ядре, и в цитоплазме.
Вы уже знаете, что присутствие вируса нарушает нормальные процессы жизнедеятельности клеток; это приводит в конечном итоге к их гибели. Разрушение клеток лежит в основе широко распространенного метода учета скорости и характера размножения вирусов. Разрушение может быть полным или частичным, когда клетка сохраняет свои очертания и основную структуру. В некоторых случаях клетки сливаются и формируются многоядерные клетки — симпласты.
Симпласты образуются во многих тканях при заражении их вирусами герпеса, кори, вакцины паротита и др. Предполагается три возможных механизма их образования:
1. Разрушение клеточных стенок с последующим слиянием цитоплазмы в одну общую массу. Этот процесс характерен для сложноустроенных вирусов, содержащих в своем составе ферменты (парагриппозные вирусы и др.).
2. Деление ядер, не сопровождающееся делением цитоплазмы. Так возникают небольшие симпласты, которые правильнее было бы назвать многоядерными клетками.
3. Захват зараженными клетками окружающих нормальных клеток (цитофания). Это редко встречающийся способ образования симпластов.
Следует подчеркнуть, что формирование симпластов — важный диагностический признак, который наряду с другими позволяет определить присутствие в исследуемом материале вируса.
Для выяснения механизма и скорости образования симпластов идеален микрокинематографический метод исследования. С помощью кино удается легко и наглядно выявлять детали процесса симпластообразования и его основные закономерности. На рисунке вы видите одну и ту же группу клеток СОЦ и через 30 и 60 минут после заражения. Посмотрите внимательно! Незараженные клетки лежат изолированно друг от друга, хорошо видны клеточные оболочки. Через 30 минут после заражения начинается слияние клеток; между соседними клетками образуются цитоплазматические мостики. Через 60 минут слияние клеток заканчивается и формируется единая масса цитоплазмы, включающая множество ядер, то есть то, что называется симпластом.
Очень часто в клетках, зараженных вирусами бешенства, оспы, трахомы, ящура и др., можно обнаружить необычные образования, которые получили название телец включений. Природа их долгое время оставалась неясной, хотя обнаружение включений уже давно используется для диагностики некоторых вирусных инфекций.
По мнению одних исследователей, включения представляют собой реакцию клетки на присутствие вируса и возникают в результате дегенеративных изменений в цитоплазме или ядре зараженных клеток. Другие считали включения колониями вирусов, то есть скоплением большого числа вирусов в одном месте. Продукты распада клетки могут «ходить в их состав и окружать эти скопления. Исследования последнего времени с применением наиболее совершенных методов подтвердили правильность второй теории. В подавляющем большинстве случаев эти скопления представляют собой колонию вирусов, причем их образование является закономерной стадией размножения вирусов.
Прямые опыты по изучению того, как образуются включения, были поставлены с вирусом осповакцины. Обнаружено, что в зараженных клетках частицы отдельных вирусов образуют скопления, содержащие от 5 до 40 элементарных телец. Затем через 24 часа появляются характерные тельца включений, которые имеют зернистую структуру.
Мы подробно разобрали течение явной вирусной инфекции, когда вирус ведет войну против клетки в открытую, «не скрывая своих агрессивных намерений». Но вирусная инфекция иногда протекает скрыто, без видимых проявлений. Вирус при этом проникает в клетку обычным путем и может остаться в ней неопределенно долгое время, не оказывая характерного болезнетворного действия. Больше того, он может передаваться потомству этой клетки и переходить из поколения в поколение. Может показаться, что подобный вирус не опасен для клеток. Но это не так. Как только организм попадает в неблагоприятные условия, вирус активизируется, начинает быстро размножаться и убивает клетку. В других случаях он вызывает изменение нормальных клеток в опухолевые.
Латентные, или бессимптомные, вирусные инфекции встречаются в природе чаще острых. У человека и животных латентные инфекции наблюдаются при таких заболеваниях, как герпес, полиомиелит, энцефаломиелит мышей, грипп, бешенство свиней, инфекционная анемия лошадей и т. д. Вирусы, вызывающие эти заболевания, могут очень долго, иногда всю жизнь оставаться в организме, не обнаруживая своего присутствия. Но при попадании организма в неблагоприятные условия (охлаждение, длительное освещение солнцем, эмоциональные потрясения, другие заболевания и т. п.) эти вирусы могут активироваться и проявлять свое болезнетворное действие. Таким образом, неблагоприятные условия — своеобразный провоцирующий фактор, который переводит скрытую бессимптомную вирусную инфекцию в явное заболевание. Возможно, что то же происходит при гриппе и гриппоподобных заболеваниях.
В эксперименте латентная вирусная инфекция может быть вызвана различными способами.
Некоторые вирусы могут размножаться в культуре ткани, не вызывая разрушения клеток. Например, вирус бешенства выделялся из ткани почки хомяка в течение 60 дней, причем все это время ткань сохраняла нормальный вид.
А был случай, когда клетки НЕР-2, зараженные вирусом клещевого энцефалита, пересевались без изменений в течение 10 месяцев, постоянно выделяя этот вирус.
Иногда тип вирусной инфекции зависит от того, какое количество вируса попало в организм. Порой тип инфекции связан с возрастом организма и его чувствительностью к данному вирусу.
Наконец, возможен и такой механизм латентной инфекции: под действием вредоносных факторов белковая оболочка вируса изменяется и вирусная нуклеиновая кислота как бы «замуровывается» внутри частицы и неспособна выйти наружу. Такой вирус может проникнуть в клетку и длительное время находиться в ней, оставаясь неактивным. В дальнейшем ферменты клетки разрушают оболочку вируса, и его размножение становится возможным.
Суммируем кратко данные, которые касаются двух основных типов взаимодействия вируса с клетками.
Явная инфекция напоминает заразную болезнь с эпидемическим течением. Она состоит из нескольких стадий. Вначале вирус прикрепляется к клетке, затем, с помощью клетки или своих ферментов, он освобождается от белковой оболочки, и вирусная нуклеиновая кислота проникает внутрь клетки. Начинается внутриклеточная стадия размножения вируса: обмен клетки нарушается, она начинает синтезировать компоненты вируса. При этом используются обычные для клетки механизмы синтеза белков и нуклеиновых кислот. Процесс заканчивается возникновением полноценных вирусов, гибелью клеток и выходом вновь образовавшегося вируса во внешнюю среду. Из одного вируса, таким образом, возникают десятки и сотни новых, каждый из которых обладает громадной потенцией разрушения, заражая окружающие нормальные клетки. Важно отметить, что весь процесс размножения вирусов от момента прикрепления до выхода нового потомства занимает от нескольких минут до 2—3 часов.
При втором типе вирусной инфекции, латентной, механизмы несколько иные. После проникновения внутрь клетки вирус как бы исчезает. Клетки, содержащие такой замаскированный вирус, по виду ничем не отличаются от нормальных: они активно делятся и могут длительно культивироваться в лабораторных условиях. Вирус не проявляет своего патогенного действия, он включается в ядерный аппарат клетки и при каждом ее делении передается ее потомству. Однако при попадании таких клеток в неблагоприятные условия или при обработке их вредоносными агентами (такими, как ультрафиолетовые лучи, рентгеновские лучи, сильные окислители, канцерогенные вещества), замаскированный вирус активируется, что приводит к гибели клетки.
Конечно, все, что мы рассказали, лишь приблизительная схема. Многое в механизме взаимодействия вируса с клеткой остается еще невыявленным, но бесспорно одно: чем больше мы будем знать о наших невидимых и коварных врагах — вирусах, тем легче будет справиться с многочисленными и тяжелыми заболеваниями, которые они вызывают.