Биолог, изучающий живое свечение, важное значение придает своим регистрирующим приборам.
Его научные достижения в большой степени обязаны хорошей аппаратуре. Он стремится сделать все возможное, чтобы уловить как можно полнее скудные лучи света, идущие от тканей, чтобы свести ошибки измерения к минимуму и получить достоверные данные. Для этого биологу приходится изучать физику, радиотехнику и электронику — малознакомые для него отделы науки. Это характерно не только для специалистов по биолюминесценции. Может ли астроном работать с плохим телескопом? Много ли новых изотопов откроет радиохимик, не располагая прецизионным масс-спектрографом? Любое научное исследование тесно связано с точными приборами. Ученые, занимающиеся биолюминесценцией, особенно остро чувствуют роль аппаратуры. Ведь телескоп и масс-спектрограф были изобретены давно; их усовершенствование дает в основном лишь количественные сдвиги в соответствующих разделах науки. А вот обнаружить спектральное распределение сверхслабого свечения без самых современных фоторегистраторов вообще невозможно. В этом случае применение аппаратуры приводит к качественно новому уровню работы.
Как мы знаем, еще Гурвич в 20-х годах мучительно искал способы обнаружения предполагаемого живого свечения ничтожной интенсивности. Он остановился на биологических индикаторах в силу необходимости — в то время не было точных приборов соответствующей чувствительности. На первый взгляд это кажется странным: в то время имелись уже различные фотоэмульсии и превосходные оптические усилители света. Неужели эти устройства не могли конкурировать с прорастающими корешками?
Но прежде, чем удивляться, вспомним о хорошо знакомом нам ‘«биоиндикаторе» света — о нашем собственном глазе. Что можно сказать о нем как об оптическом приборе? Гельмгольц сказал однажды, что если бы мастер принес ему столь несовершенный инструмент, как человеческий глаз, он выругал бы его за недоброкачественную работу. Хотя эту мысль высказал великий ученый, она не соответствует истине.
Глаз человека и высших животных представляет собой поразительный по совершенству инструмент, несравнимый ни с каким искусственным прибором. Исполинский телескоп Маунт Паломар в США по сравнению с нашим глазом — примитивное устройство.
Действительно, что бы вы сказали о руке, которая с одинаковым усилием поднимала бы миллиграмм и тонну — в зависимости от «настройки»? Ясно, что такая ширина диапазона усилий говорила бы о исключительно высоком качестве органа, об изумительной его приспособляемости. Как раз такую приспособляемость имеет глаз.
Если вы сидите ночью на лесной опушке у костра и пламя постепенно угасает, ваши глаза адаптируются — они начинают постепенно различать окружающие деревья, кусты, далекие телеграфные столбы. Еще несколько минут, и вы видите весь пейзаж с его многочисленными подробностями. А ведь ночь безлунная и ничтожное количество света, обеспечившее вам ориентировку, идет от сияния редких облаков, освещенных далекими огнями невидимого города, рассеянного в верхних слоях атмосферы света давно зашедшего Солнца, лучей звезд. Ни одна фотопластинка не могла бы уловить такой слабый поток фотонов. Если сомневаетесь, попробуйте сделать фотографию при максимальной выдержке, даже вскоре после наступления сумерек.
Академика С. И. Вавилова поражала способность глаза к адаптации, и он решил измерить ее степень точными средствами. Для этого ученый создал интереснейшую методику. Описывать ее подробно мы не имеем возможности. Кратко можем только сказать, что человека оставляли в полной темноте и после длительного срока адаптации изучали реакцию его глаза на сверхслабые световые потоки. Получились ошеломляющие данные: глаз человека способен видеть вспышки света, при которых роговицы достигают всего 100 фотонов! Для сравнения укажем, что если вы будете смотреть на стеариновую свечу с расстояния в один метр, то за каждую секунду на вашу роговицу попадает десять миллиардов фотонов. А ведь смотреть на пламя свечи совсем не больно, и оно не кажется особенно ярким.
Уже после смерти С. И. Вавилова исследования были продолжены его учениками. Усовершенствованная методика позволила раскрыть еще более сенсационные факты. Недавно Н. И. Пинегин сообщил, что по данным измерений минимальный порог чувствительности светоприемных элементов глаза (так называемых палочек и колбочек) равен всего двум квантам. Этот результат дает основание думать, что человеческий глаз в принципе может увидеть отдельный фотон. Но коль это так, значит нет ничего удивительного и в светочувствительности корешков лука, в явлении митогенеза. Если одна живая ткань столь восприимчива к фотонам, то этим же свойством может обладать и другая живая ткань.
Помимо чувствительности (при условии адаптации) глаз имеет и другое колоссальное преимущество перед любым прибором — он широкоуголен. Это значит, что глаз улавливает свет, идущий из очень большого телесного угла. Именно это свойство дает нам возможность любоваться такими большими созвездиями, как Орион или Большая Медведица (в бинокль видны только отдельные звезды) и реагировать на опасность, появляющуюся сбоку. Как совершенен в этом смысле наш глаз, показывает тот факт, что до сих пор не достигли особого успеха попытки создания высококачественного панорамного кино, несмотря на использование сразу многих проекционных камер.
А глубина резкости? Без всякого напряжения мы видим одновременно и муху, ползущую по стеклу окна, и лес, находящийся на горизонте. Перестройка фокусировки глаза молниеносна, оперативна, безошибочна.
Из всего сказанного вовсе не следует, что для исследования сверхслабой люминесценции нужно посадить человека в темную комнату и попросить его смотреть на излучающую ткань и рассказывать об увиденном. Глаз — чересчур универсальный инструмент для тех сравнительно простых задач, которые стоят сейчас перед специалистами по живому свечению. Для этого нужны специализированные инструменты. Глаз таким не является — он приспособлен к осуществлению сразу многих функций. Кроме того, всякое научное измерение обязано располагать точной количественной мерой, давать надежные цифры. Глаз же человека подвержен оптическим иллюзиям, не может точно измерять интенсивность, он устает и внимание его слабеет.
Кроме того, наш глаз, несмотря на все его совершенство, воспринимает только незначительную часть спектра электромагнитных волн, или фотонов. Это особенно хорошо видно, если сравнить видимые и невидимые диапазоны, пользуясь понятием «октава», используемым в теории музыки. Одна октава — это такой диапазон частот (или длин волн), в котором высшая частота ровно вдвое больше низшей. Шкала фотонов разбивается на области, содержащие различное число октав; меньше всего их в той области, которая доступна глазу:
- Радиоволны — 20 октав
- Тепловые лучи — 20 октав
- Видимый свет — 1 октав
- Ультрафиолетовые лучи — 7 октав
- Рентгеновские лучи — 8 октав
- Гамма-лучи — 3 октав
Несмотря на относительную узость видимой полосы, подавляющая часть информации о внешнем мире идет к нам через наш глаз. Однако при исследовании люминесценции тканей необходимо регистрировать не только видимые фотоны. Например, были проведены эксперименты, проверявшие гипотезу А. А. Гурвича об ультрафиолетовом свечении прорастающих корешков.
В конечном счете от прибора требуется, чтобы он был очень чувствительным; обладал широким или регулируемым диапазоном восприятия; принимал фотоны, летящие в сравнительно узком телесном угле, имел возможность изучать люминесценцию различных участков тканей; располагал счетчиком или какой-либо приставкой, позволяющей осуществлять количественные измерения. Короче говоря, нужен «механический глаз» — бесстрастный, не подверженный ошибкам, узко направленный, не устающий, считающий отдельные фотоны как можно более широкого диапазона энергий.
Фотопластинка явно не удовлетворяет перечисленным требованиям. Она недостаточно чувствительна и этим сразу лишает себя права участвовать в исследованиях сверхслабого свечения. К тому же почернение эмульсии вызывается лишь длительным действием света, поэтому с помощью пластинки нельзя изучать зависимость интенсивности биолюминесценции от времени, т. е. производить одно из наиболее важных измерений (например, измерение времени послесвечения).
Создать необходимый для исследования биолюминесценции прибор позволил фотоэлектрический эффект (сокращенно фотоэффект), объясненный Эйнштейном в 1905 г. Именно за теорию этого эффекта (а не за теорию относительности!) Эйнштейн был удостоен Нобелевской премии в 1921 г.
Явление состоит в следующем: свет, падая на поверхность заземленного проводника, вызывает движение зарядов, создает ток. При увеличении интенсивности света сила тока пропорционально возрастает. Но если менять длину волны света в сторону ее увеличения, то настает момент, когда ток прекращается и равен нулю при любой интенсивности света. Для каждого проводника имеется свой порог, своя частота света, которая еще производит ток, в то время как более мягкие лучи тока уже не дают.
Сейчас кажется, что объяснение Эйнштейна напрашивается само собой, однако в то время оно требовало перестройки мышления от классических представлений к квантовым. Великий физик понял, что наличие порога в фотоэлектрическом эффекте обязано не волновым свойствам, а тому, что свет состоит из отдельных частиц — фотонов. В этом случае появление тока связано с индивидуальными свойствами фотона, а уже сила тока — с общим количеством фотонов, т. е. с интенсивностью света.
Как мы знаем, энергия фотона пропорциональна его частоте. Падая на проводник, фотон должен выбить из его поверхности электрон — тогда появится избыточный положительный заряд, и из земли на проводник придет новый электрон взамен выбитого, возникнет ток. Но электрон неохотно покидает кристалл проводника, ибо между электроном и положительно заряженными центрами решетки действуют силы притяжения. Для каждого вещества (это, впрочем, зависит также и от обработки поверхности) имеется определенное значение минимальной энергии, необходимой для удаления электрона из кристалла. Ясно, что если энергия фотона окажется меньше этого значения, электрон выбит не будет. Пороговое значение энергии выбивания электрона, известное также под названием «работа выхода», связано не только с фотоэффектом, но и с явлениями протекания тока в батареях.
Когда свет достаточно жесткий, т. е. длина волны достаточно мала, энергия отдельного фотона превосходит работу выхода. Такой фотон может вырвать электрон из поверхности проводника и даже останется лишняя энергия. Она трансформируется либо в новый фотон, который будет, разумеется, мягче прежнего, либо в кинетическую энергию вылетевшего из кристалла электрона. Представим теперь, что энергичных фотонов много, т. е. проводник освещен ярко. С поверхности в этом случае полетят целые потоки электронов, на их место двинутся новые, возникнет измеримый приборами ток. Этот ток будет существовать до тех пор, пока проводник не уберут из под лучей света.
Все, кто был в московском метро, знают об автоматическом контролере. Проходя контрольный пост, пассажир пересекает луч света, падающий на проводник. Ток, обязанный фотоэффекту, прекращается, и это прекращение фиксируется счетчиком. Фотоэффект, следовательно, вошел сегодня в наш быт в широчайшем масштабе.
Фотоэффект важен не только для практики, но и для науки. На его использовании основан такой важный измерительный прибор, как фотоэлектронный умножитель (ФЭУ). Принцип действия ФЭУ очень прост.
Фотон падает на поверхность проводника с достаточно малой работой выхода. Этот проводник называется катодом. Конструктивно он выполнен так: на металлический электрод нанесен слой вещества, легко теряющего электроны; все это помещено в стеклянный сосуд, полость которого откачана вакуумным насосом. Если бы возникший из-за выбивания электронов ток сразу регистрировался, мы получили бы прибор, называемый фотоэлементом. В данном случае выбитый электрон стараются использовать с наибольшей выгодой — его заставляют пройти ускоряющее электрическое поле с некоторой разностью потенциалов. В конце пробега электрона через поле помещен второй электрод, называемый эмиттером или динодом. В нем также имеются свободные электроны, готовые выйти с поверхности при сравнительно небольшом толчке извне. В случае фотоэффекта этот толчок сообщался электрону фотоном. Но электроны могут выскакивать наружу от удара другого электрона, обладающего большой кинетической энергией.
Итак, схема работы прибора такова: фотон выбивает из катода электрон. Электрон подвергается ускорению внешним полем и налетает на эмиттер, из которого выбивает новые электроны — уже не один, а несколько, ибо энергия первоначального электрона стала значительной из-за ускорения полем. Каждый из этих электронов снова подвергается ускорению электрической разностью потенциалов и направляется на поверхность следующего эмиттера. Процесс «размножения» электронов многократно повторяется (например, 10 раз). С последнего эмиттера электроны собираются электродом, находящимся под положительным потенциалом — анодом. Количество электронов, приходящих к аноду в единицу времени, определяет величину анодного тока, измеряемого чувствительным микроамперметром. В то же время количество электронов на выходе определяется количеством фотонов на входе. Вся цепочка создана для увеличения возможности замечать фотоны. Один фотон не «поймаешь» прибором. Но этот фотон породил электрон, электрон выбил из эмиттера еще три электрона, которые выбили из следующего эмиттера девять электронов и т. д. На последнем электроде, аноде, возник всплеск тока уже из 310, т. е. примерно из миллиона электронов. Один единственный фотон дает миллион электронов! Понятно, что возможности регистрации света с помощью ФЭУ становятся огромными.
Мы не будем вдаваться здесь в подробности техники измерений на ФЭУ и правил эксплуатации этих устройств. Скажем, однако, что фотоэлектронные умножители могут быть измерителями среднего потока света и регистраторами отдельных вспышек. В измерениях сверхслабой биолюминесценции ФЭУ работает на пределе своей чувствительности, поэтому тут большую роль играет обеспечение максимальной надежности результата. Ведь с катода умножителя даже при отсутствии всякого источника света может «сорваться» шальной электрон. Такой вылет будет произведен тепловым движением частиц поверхностного слоя катода. Известно, что при данной температуре не все молекулы или атомы имеют одинаковую кинетическую энергию; в силу случайных факторов одни частицы движутся намного быстрее большинства, другие — значительно медленнее. Тепловыми скоростями обладают и электроны. Сталкиваясь друг с другом и с центрами кристаллической решетки, они то замедляются, то ускоряются. Несколько попутных толчков — и электрон начинает двигаться быстрее нормы. Если при этом его скорость окажется направленной от поверхности электрода к внешнему пространству, кинетической энергии может хватить, чтобы преодолеть удерживающие силы. Работа выхода совершится за счет тепловой энергии. Электрон покинет катод и создаст лавину, описанную выше.
Значит ФЭУ с предельно высоким коэффициентом усиления будет иметь «темновой ток», который будет существовать на аноде даже при отсутствии света. Он будет как бы фоном, на котором возникнет сигнальный ток, вызванный фотонами. Естественно, для повышения точности измерений фототока нужно сделать фоновый ток как можно меньше. Но чтобы добиться этого, необходимо стараться устранить тепловые всплески лавины, свести к минимуму «испарение» электронов из катода. Для этого хорошо помещать фотоэлектронный умножитель в глубокий холод. Из охлажденного катода будет вылетать значительно меньшее количество спонтанных электронов, ибо средняя энергия теплового движения резко уменьшится, а значит случайное появление быстрых электронов станет явлением очень редким.
ФЭУ охлаждают обычно сухим льдом (—78° С) и жидким азотом (—196°С). Применение жидкого азота оказывается особенно эффективным: оно снижает значение темнового тока в несколько десятков тысяч раз. В этом случае прибор способен улавливать световые потоки, состоящие из сотен или даже десятков фотонов в секунду.
Первый фотоэлектронный умножитель был построен советским физиком Кубецким еще в 1934 г. Но сразу после своего создания чувствительный прибор фактически не использовался. Начиная с 1948 г., под влиянием возросших требований физического эксперимента к регистрирующей аппаратуре началась усиленная разработка ФЭУ, чувствительных к очень слабым световым потокам.
Для изучения сверхслабой люминесценции живых тканей фотоэлектронные умножители были впервые применены, по-видимому, Стрелером в США в 1951 г. Затем ФЭУ применили итальянские биологи Колли и Фаччини в 1954 г. Их работа, как мы знаем, увенчалась большим успехом — было открыто явление сверхслабой биолюминесценции проростков лука и других объектов в видимой области спектра. Несколькими годами позже подобные установки с охлаждением жидким азотом, работающие в импульсном режиме, были построены в Советском Союзе Ю. А. Владимировым и Ф. Ф. Литвиным. При помощи этой чувствительной аппаратуры были проведены исследования фотолюминесценции пигментов листа, аминокислот и белков, дрожжевых клеток и бактерий.
Свет от объекта в опытах Ю. А. Владимирова и Ф. Ф. Литвина собирался линзой, ФЭУ был погружен в сосуд Дьюара. Импульсы тока, появляющиеся на выходе ФЭУ, усиливались импульсным усилителем и подавались на пересчетный блок, который показывал среднее количество импульсов за секунду.
Появление в биологической лаборатории ФЭУ произвело революцию. Стало возможным то, что не давалось в руки раньше. Резко увеличился объем информации, идущей к ученым из живой клетки, из того крошечного мира с ядром, протоплазмой и оболочкой, ради раскрытия тайн которого, по существу, делаются все биологические исследования.