При культивировании мицелия съедобных грибов на жидких средах особо важное значение приобретают идентификация культур базидиомицетов и контроль за чистотой культуры, начиная с момента выделения и кончая готовым продуктом.
Уже в первые годы культивирования мицелия на жидких средах имели место ошибки, когда вместо съедобного гриба в промышленных масштабах культивировали несовершенный или низший гриб. Такова печальная судьба Agaricus campestris, фигурирующего в ряде работ и впоследствии идентифицированного как Beauveria. Подобные ошибки можно объяснить недооценкой необходимости изучения культивируемого гриба в онтогенезе, точного знания его морфологии, четкой идентификации типов бесполого или вегетативного спороношения.
При выделении чистой культуры из плодовых тел или базидиоспор прежде всего необходимо правильно установить с помощью определителя вид гриба, исходя из морфологических признаков плодовых тел, собранных для выделения. После выделения мицелиальной культуры необходимо убедиться в том, что это действительно культура предполагаемого гриба, а также при дальнейшем культивировании постоянно осуществлять контроль за чистотой культуры по культуральным и морфологическим признакам. Если культура получена путем проращивания базидиоспор, то вероятность ошибки меньше, так как прорастание можно наблюдать непосредственно из базидиоспоры. Из базидиоспор вырастает первичный, гаплоидный мицелий, состоящий из тонких тонкостенных многоклеточных гиф. Возникновение вторичного, диплоидного мицелия у гетероталличных видов происходит при встрече вершинных клеток первичных мицелиев, возникших из разных спор, или же путем образования анастомозов между ветвями первичных мицелиев. У гомоталличных видов диплоидизация происходит обычно в результате образования анастомозов между ветвями одного и того же мицелия.
Мицелиальная культура, полученная из плодового тела, состоит из диплоидного мицелия, для которого у многих высших базидиомицетов характерны так называемые пряжки. Наличие пряжек в мицелии служит несомненным доказательством принадлежности гриба к высшим базидиомицетам. Однако пряжки могут и отсутствовать у представителей этой систематической группы. Наличие или отсутствие пряжек на мицелии характерно для отдельных видов. Пряжки обнаружены на мицелии видов, относящихся к родам Clitocybe, Collybia, Coprinus, Lepista, Nematoloma, Pleurotus, Marasmius, Oudemansiella, Pholiota, Flammulina, Schizophyllum, Kuehneromyces, Phallus, и у большинства афиллофоральных грибов. Пряжки отсутствуют у многих видов родов Agaricus, Amanita и у Boletus edulis Fr., Armillariella mellea, Laetiporus sulphureus (Bull.) Bond, et Sing., Fomitopsis annosa (Fr.) Karst., Phaeolus schweinitzii (Fr.) Pat. и др. У некоторых видов пряжки обильные, у других — единичные. За появлением пряжек нужно следить уже на самых ранних стадиях выделения в культуру, когда на инокулюме и вокруг него на агаре начинает расти молодой мицелий, так как в более старых культурах пряжек иногда обнаружить не удается. В некоторых случаях пряжки удается заметить лишь со временем, после нескольких пересевов гриба на разные среды. Кроме пряжек имеется целый ряд микроскопических признаков, характерных для высших базидиомицетов, но встречающихся и у грибов из других систематических групп: анастомозы, медальоны, вздутия, тяжи, ризоморфы, инкрустированные гифы и др. При идентификации культур эти признаки следует принимать во внимание в совокупности со всеми морфолого-культуральными особенностями данного вида в условиях искусственной культуры.
Многие высшие базидиомицеты в условиях искусственной культуры образуют бесполые спороношения — конидии, оидии, хламидоспоры. Это Flammulina velutipes, Cortinarius delibutus Fr., Pholiota adiposa, Ph. aurivella (Fr.) Quel., Laetiporus sulphureus, Panus tigrinus и др. Необходимо точно установить тип конидиального спороношения, если таковое имеется, и сравнить с описанными в литературе для данного гриба. Простое указание на то, что гриб в культуре образует споры или, как их иногда неопределенно называют «вторичные», или «секундарные» («secondary»), споры, может привести к серьезным ошибкам. Конидиальные спороношения обычно имеют выраженную видовую специфичность. Хламидоспоры же, оидии, как правило, сходны у многих видов и родов. Если описание морфологических признаков выделяемого в культуру гриба отсутствует в литературе, то необходимо провести неоднократные выделения из разных плодовых тел, собранных в различных местообитаниях, и убедиться в идентичности полученных изолятов.
Важным признаком для характеристики вида являются скорость и характер роста на различных средах, окраска мицелия и субстрата, наличие тяжей, ризоморф, выделение эксудата, запах. В глубинной культуре мицелий съедобных грибов часто растет в виде различного размера мицелиальных клубочков или агломератов шаровидной либо неправильной округлой формы. В культуральной жидкости наблюдается всегда также значительное количество обломков мицелиальных нитей. При росте некоторых грибов преобладают более крупные мицелиальные шарики, хотя при микроскопическом исследовании удается обнаружить и значительное количество мелких. В тех случаях, когда мы говорим о дисперсном росте, преобладают очень мелкие мицелиальные шарики или разной длины гифы, часто трудно различимые невооруженным глазом. В центральной части мицелиальный клубочек состоит из более или менее плотно переплетенных гиф. От периферической части отходят свободные гифы, иногда образующие длинные тяжи. В центральной части такой шаровидной колонии у некоторых грибов наряду с обычными тонкими встречаются утолщенные вздутые искривленные гифы. Размер мицелиальных шариков не является постоянным для каждого гриба, он может значительно изменяться от количества и дисперсности посевного мицелия, аэрации, состава питательной среды и т. д. Однако, очевидно, тенденция к дисперсному росту или росту в виде более крупных шариков у отдельных видов имеется. Образование очень крупных колоний наблюдалось нами у Schizophyllum commune, а также у гастеромицета Scleroderma sp. Интересно, что последний гриб при выращивании в колбах, когда посев производится с агаровых косяков, растет в виде одного или немногих больших комков мицелия.
Дисперсному росту мицелия, по данным разных авторов, способствует добавление в среду СаСO3 или агара. По нашим данным, добавление в питательную среду небольших количеств (0,01—0,1%) таких механических мелкодисперсных компонентов, как агар и CaCO3, не оказывало заметного влияния на размер мицелиальных шариков. Добавление агара приводило к увеличению биомассы всех испытанных грибов; добавление СаСO3 отчетливо тормозило накопление биомассы у грибов, проявляющих тенденцию к образованию крупных колоний.
При выращивании съедобных грибов на жидких средах должен проводиться также постоянный микробиологический контроль. Вначале устанавливают чистоту и морфологическую однородность посевного материала. Чтобы убедиться в том, что посевной материал не загрязнен бактериями, его высевают на бульон и агар Хоттингера или МПБ с 0,5% глюкозы и МПА. Инкубацию проводят в течение 2—3 суток при температуре 37° С. Для выявления возможного загрязнения дрожжами или другими грибами производится посев на сусловый агар или среду Чапека, при последующей инкубации при температуре 25° С и 37° С до 5 суток. В конце каждой ферментации необходимо произвести посев на агаровую среду выросшей в культиваторе мицелиальной культуры и сравнить ее культурально-морфологические признаки и микроскопическое строение с исходной культурой. В ряде случаев в процессе глубинной ферментации может произойти засорение и вытеснение мицелиальной культуры съедобного гриба другим более быстро растущим мицелиальным грибом из несовершенных, фикомицетов и др.
В литературе имеется очень мало данных о морфологии базидиомицетов, растущих в глубинной культуре. На наличие вегетативных спор у Agaricus blazei, прорастающих при глубинном выращивании, указывают С. С. Блок и другие. И. Штарка отмечает наличие оидий у Hypholoma hydrophilum в культуре. Нами при изучении в глубинной культуре съедобных базидиальных грибов из разных экологических и систематических групп было отмечено наличие бесполого и вегетативного спорообразований. Конидии наблюдались нами у Pholiota adiposa, Ph. aurivella, Clitocybe nebularis, Russula decolorans, Lycoperdon pyriforme, Laetiporus sulphureus, Sparassis crispa; хламидоспоры у видов Agaricus, Coprinus ephemerus, Lepista nuda, Calvatia caelata, C. excipuliformis, Fistulina hepatica, Laetiporus sulphurues. В большинстве случаев такие же образования отмечены у этих грибов при росте на агаровых средах. Как правило, грибы, образующие при росте на агаризованных средах пряжки, сохраняют эту способность и в глубинной культуре.
Наиболее сложной задачей представляется идентификация неспороносящего вегетативного мицелия без пряжек. В таком случае необходимо провести дополнительные исследования с целью получения плодоношений. При этом должны быть использованы как методы, индуцирующие спороношения у несовершенных грибов и фикомицетов, так и методы, индуцирующие образование плодоношений у базидиомицетов, о чем будет сказано ниже. Если у сомнительной культуры не удается получить плодоношений или характерных бесполых спороношений, то принадлежность к базидиомицетам может быть достоверно установлена с помощью электронно-микроскопического исследования по строению межклеточной перегородки.
В настоящее время идентификация культур высших базидиомицетов представляет значительные трудности из-за отсутствия соответствующих пособий. Ключи для определения, главным образом, дереворазрушающих грибов по культуральным признакам приводят С. Ванин, М. Ноблз. М. Ноблз дает полигамический ключ для определения 149 видов (114 видов семейства Polyporaceae, 21 вид семейства Thefephoraceae, 12 видов семейства Agaricaceae, 1 вид семейства Hydnaceae). Характеристику и описание чистых культур дереворазрушающих грибов можно найти также в работах У. Бавендамма. Описание культур отдельных видов агарикальных и болетальных грибов приводят В. Я. Частухин и М. А. Николаевская; характеристика культуральных признаков 57 видов грибов семейства Agaricaceae дана М. Семерджиевой.
Получение в культуре нормально развитых плодовых тел является наиболее надежным способом правильного определения культуры. Легко образуют плодовые тела в обычных лабораторных условиях Flammulina velutipes, Panus tigrinus, Nematoloma sublateritium (Fr.) Karst., Schizophyllum commune, виды родов Pholiota, Pleurotus, Coprinus и др. Разными исследователями получены в условиях культуры плодовые тела многих афиллофоральных грибов из родов Fomes, Phellinus, Coriolus Coriolellus, Coriolopsis, Coniophora, Ganoderma, Lenzites и др. Попытки получения в культуре плодовых тел большинства микоризных грибов были неудачны. Из болетальных грибов плодовые тела в условиях культуры образовывают виды родов Phlebopus и Xerocomus; зачатки плодовых тел наблюдаются у грибов из родов Boletus, Leccinum, Pulveroboletus. Отмечено образование в культуре плодовых тел гастеромицетов Lycoperdon pusillus Pers., Cyathus stercoreus (Schw.) De Toni.
Имеющийся в настоящее время экспериментальный материал по плодоношению базидиальных грибов в культуре, главным образом легкоплодоносящих, которые упоминались выше, позволяет указать на некоторые факторы, влияющие на образование плодовых тел. К ним относятся прежде всего свет, состав питательной среды, температура, влажность, аэрация. Однако ряд факторов внешней среды, а также генетическое и физиологическое состояние грибов, определяющие плодоношение в культуре, остаются почти не изученными.
Выделяют четыре стадии в онтогенетическом развитии высших базидиомицетов: стадию вегетативного роста, стадию зачатков, стадию развития плодовых тел, стадию образования базидиоспор. Каждая из них характеризуется особенностями физиологического состояния гриба, своеобразными метаболическими процессами, требованиями к условиям внешней среды. Условия, благоприятные для плодоношения, могут находиться в более узких пределах, чем для роста мицелия, или не совпадать.
Для получения плодовых тел хорошо плодоносящих видов, таких как Flammulina velutipes, Panus tigrinus, Pleurotus ostreatus и др., обычно используют тот же субстрат, на котором сохраняется в лаборатории культура гриба,— сусловый агар, мальц-агар и т. п. В качестве питательных субстратов для получения плодовых тел многих видов рекомендуется использовать пористые субстраты: смоченные разбавленным суслом или минеральной средой древесные опилки и древесную муку, мелко нарезанные веточки и хвою, высушенный ржаной хлеб с водой, кашицу из хлебных крошек, размягченную в 40%-ном растворе лимонной кислоты. К этим субстратам можно также добавлять витамины, мальц-экстракт, дрожжевой экстракт, картофельный крахмал, муку различных зерновых культур, казеиновый гидролизат. Для дереворазрушающих грибов применяется среда Э. Бэдкока, состоящая из древесной муки с добавкой костной муки, картофельного крахмала, сахара и древесной золы. Для получения плодовых тел можно использовать также следующие питательные среды:
Богатый питательными веществами субстрат, способствующий хорошему вегетативному росту мицелия, не всегда является оптимальным для образования плодовых тел. В некоторых случаях перенос гриба не бедную среду стимулирует плодоношение. Специальные исследования, проводимые в отношении отдельных видов, не позволяют пока установить четкой зависимости плодоношения от того или иного компонента питательной среды. В ряде случаев не наблюдается специфичности по отношению к источникам углерода и азота в связи с появлением плодовых тел. Оптимальный для плодоношения pH среды обычно лежит в более узких пределах, чем pH среды, благоприятный для мицелиального роста гриба. Оптимальным для плодоношения Flammulina velutipes является pH 5—6, для Ganoderma lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst., Lentinus edodes, Hericium erinaceum (Fr.) Pers. — около 4, Agaricus bitorquis (Quel.) Sacc. — 5—6.
Стимулировать появление плодовых тел можно, если на поверхность колонии поместить кусочек плодового тела гриба, даже другого вида. В таком случае плодовое тело образуется на некотором расстоянии от стимулирующего кусочка. Получить плодоношение можно как на твердых, так и на жидких средах, однако на жидкой среде плодовые тела обычно появляются позднее.
Время появления плодовых тел различно в зависимости от вида и штамма гриба, условий выращивания и состояния культуры. Обычно плодовые тела появляются на достаточном количестве мицелия через 3—12 недель. У болетального гриба Phlebopus sulphureus (Fr.) Sing, плодовые тела 8 см высотой были получены после пересевов в культуре в течение 2 лет. Ввиду длительного срока, предшествующего образованию плодовых тел, следует выращивать культуру на достаточном количестве питательной среды, лучше в колбах или больших пробирках. Для получения плодовых тел можно также использовать банки из-под варенья, бутылки с удаленным дном. В последнем случае бутылку заполняют опилками, закрывают с обеих концов корковыми или ватными пробками и производят посев через горлышко. Засеянные мицелием бутылки переворачивают кверху дном. Мицелий прорастает всю среду и в верхней части сосуда образуются плодовые тела, пробки к этому времени следует удалить.
Для получения плодовых тел некоторых видов рода Agaricus используется метод «чашечных половинок» Эгера, с помощью которого впервые были получены плодовые тела Agaricus silvaticus.
Чашки Петри наполовину заполняют компостированным конским навозом или таким же навозом в сочетании с дерновой почвой в соотношении 7 : 3, 1 : 1. Чашки с навозом стерилизуют и инокулируют мицелием, выращенным на зерне с последующей инкубацией при 24° С. Через 10—14 суток после инокуляции пустую половинку чашки Петри засыпают увлажненной смесью дерновой земли, низинного торфа и мела в соотношении 2:1: 0,03. Дальнейшую инкубацию чашек проводят под стеклянным колпаком при комнатной температуре и естественном освещении. При появлении зачатков плодовых тел земляной слой слегка увлажняют и чашки периодически вынимают из-под колпаков.
Температура, оптимальная для плодоношения, отличается у разных грибов и, очевидно, определяется экологическими условиями, в которых происходит плодоношение этих грибов в природе, и часто не совпадает с оптимальной температурой для роста мицелия. К группе грибов, у которых максимум плодоношения не выше 24° С, а оптимум около 20° С, относятся Flammulina velutipes, Agaricus bisporus, Lentinus edodes, Pleurotus sapidus, Hericium erinaceus и др. Для получения обильного плодоношения зимнего гриба — Flammulina velutipes необходимо понижение температуры до 5—10° С как минимум в течение 2 суток или до 15° С в течение 0,5 суток с последующей инкубацией при температуре не выше 20° С. Бурное образование плодовых тел этого гриба происходит при 10—15° С, в то время как оптимальная температура для роста мицелия находится между 22 и 26° С. Плодоношению F. velutipes способствуют колебания температуры между 5 и 20° С; увеличению числа плодовых тел Serpula lacrymans — снижение температуры до 13—14° С в течение 8 дней. К грибам с оптимумом плодоношения 20—24° С и максимумом 28° С относятся Pholiota adiposa, Auricularia auricula-judae, Agaricus bitorquis, A. rubellus Gill., Tremella fuciformis и др. К видам с оптимумом плодоношения 24—27° С и максимумом 30—36° С относятся Oudemansiella radicata, Goprinus lagopus, Pleurotus rhodophyllus, Ganoderma lucidum и др. Температура 25° С является благоприятной как для плодоношения Сорrinus lagopus, так и для роста мицелия этого гриба.
Свет является одним из наиболее существенных условий для развития плодовых тел. У многих видов в темноте или при недостаточном освещении образуются лишь зачатки плодовых тел в виде цилиндрических или другой формы выростов. Интенсивность и продолжительность освещения влияют на сроки появления плодовых тел, их величину, окраску, форму, степень развития. Для получения плодоношения используют рассеянный солнечный или искусственный дневной свет. Образование плодовых тел у Flammulina velutipes и Coprinus lagopus стимулируется синей частью видимого спектра (наиболее эффективен свет с длиной волны 520 мк). Появлению большого количества спорофоров у Lenzites abietina способствует освещение фиолетовой частью спектра, в меньшей степени — синей, зеленой, желтой и красной. Для образования плодовых тел целого ряда высших базидиомицетов эффективен свет голубой части спектра, очень слабое действие оказывает красный цвет.
Потребность разных видов в освещении для образования нормальных плодовых тел различна. На первых стадиях развития зачатков плодовых тел достаточно незначительного освещения. Для образования зачатков плодовых тел у Panus fragilis необходимо лишь 1,5 ч дневного освещения, для образования же сформированных плодовых тел — более 6 ч. Для образования плодовых тел Polyporus versicolor Fr. требуется освещение 1000 лк в течение не менее 8 ч; Pleurotus ostreatus — 2—8 тыс. лк в течение 14 ч. Плодовые тела Flammulina velutipes могут быть получены лишь при слабой силе света. Образование зачатков плодовых тел без света может происходить у Auricularia auricula-judae, Pholiota adiposa, Flammulina velutipes, Agaricus bitorquis и некоторых других. Свет необходим для образования зачатков и развития плодовых тел Ganoderma lucidum, Lentinus edodes, Armillariella mellea, Volvariella bombycina (Fr.) Sing., Pleurotus sapidus Kalchbr., Tremella fuciformis Berk, и др. Увеличение дневного периода освещения и интенсивности света приводит обычно к более раннему и обильному образованию плодовых тел, их нормальному формированию и пигментации.
Аэрация и влажность оказывают влияние на образование и формирование плодовых тел. Снабжение культур свежим воздухом, относительной влажностью 80—90% благоприятно сказывается на развитии плодовых тел. При высоком содержании в среде СO2 наблюдается появление абортивных плодовых тел и задержка развития шляпки, изменяются ее размеры и появляются морфологические изменения. Если воздух не обновляется, то могут образовываться лишь зачатки плодовых тел. К образованию ненормальных шляпок, появлению новообразований может приводить воздействие паров минеральных масел, каменноугольного дегтя и др. При низкой транспирации происходит уменьшение числа плодовых тел, подавление роста шляпки, особенно у грибов семейства Polyporaceae. Полученные в культуре плодовые тела должны быть идентифицированы по морфологическим признакам, описанным в литературе для плодовых тел, произрастающих в природных условиях.