В литературе описано множество методов искусственного заражения, позволяющих сравнительно легко и быстро обнаруживать возбудителей бактериальных болезней. Некоторые из этих биотестов представлены ниже.
Тест на мокрую гниль по Штаппу. Обнаружение пектолитически активных возбудителей лучше всего удается по методике Штаппа. Работу проводят так же, как при накоплении возбудителей мокрой гиили, например Е. carotovora var. atroseptica. Вместо клубней картофеля можно использовать ломтики лука или моркови.
Заражение побегов для обнаружения возбудителя мокрой гнили по Штаппу и Шпихеру. Если есть подозрение, что бактериальная культура представлена возбудителем мокрой гнили, проводят следующий тест: молодые срезанные побеги картофеля длиной около 10 см с удаленной верхушкой ставят в пробирки, содержащие по 2 мл смыва с колоний проверяемого изолята. При наличии возбудителя через 24—48 ч развивается гниль стеблей. Контролем служат побеги картофеля в пробирках с водой.
Тест на ломтиках моркови для обнаружения Agrobacterium rhizogenes по Арку и Томпсону. Agrobacterium rhizogenes близкородственна возбудителю бактериального рака плодовых культур Agrobacterium tumefaciens. Оба вида относятся к раневым паразитам и при заражении молодых деревьев яблони или вишни вызывают на корнях аномалии, проявляющиеся в развитии тонких «волосяных» корней. Только через несколько месяцев после заражения «волосяные» корни можно надежно отличить от галлов и опухолей, вызванных A. tumefaciens. Биотест на ломтиках моркови позволяет четко идентифицировать A. rhizogenes в течение двух недель.
При наличии чистой культуры возбудителя вымытую и очищенную морковь нарезают ломтиками толщиной 1—1,5 см, инокулируют их культурой в возрасте 36 ч, нанося суспензию стерильной пипеткой на всю поверхность среза, а затем выдерживают в чашках Петри с влажной фильтровальной бумагой при комнатной температуре.
Через 5—10 дней на поверхности инокулированных ломтиков появляются первые опухоли, позже из них вырастают многочисленные мелкие волосяные корни. В отличие от A. rhizogenes, инокуляция ломтиков моркови A. tumefaciens вызывает образование только опухолей.
Если чистой культуры A. rhizogenes нет, то в вышеописанной методике бактериальную суспензию можно заменить мацератом ткани волосяных корней.
Тест на плодах груши для обнаружения Erwinia amylovora. Тест на плодах груши основан на специфической реакции молодых незрелых плодов на инокуляцию возбудителем ожога Erwinia amylovora. Бактериальную суспензию вводят в плоды груши, бактерии должны быть выращены в чистой культуре или содержаться в гомогенате пораженной ткани. Еще более достоверное обнаружение обеспечивает пересадка кусочка пораженной ткани в плод. По этой методике в незрелом плоде прокалывают дырочки, используя стерильный пинцет или препаровальную иглу, и вдавливают в них пробы исследуемого материала. Через 2—7 дней после пересадки в месте инфекции выступают характерные беловатые капли слизи. Для этого теста пригодны плоды сортов Alexander Lucas, Conference, William Christ и непригодны Nordhauser Winterforelle, Prinzessin Marianne, Gellerts Bntterbirne.
Высокоинфекционный материал (исследуемые пробы, инокулированные плоды и др.) после окончания теста необходимо полностью уничтожить путем сжигания или автоклавирования при летальном режиме.
Тест на горохе для обнаружения Corynebacterium fascians поКёну. Corynebacterium fascians, встречающаяся на многих декоративных растениях (аспарагусе, бегонии, хризантеме, пеларгонии), а также на горохе и землянике, вызывает заметные аномалии роста у своих хозяев. Этот признак можно использовать для идентификации бактерии с помощью простого биотеста. Семена гороха поверхностно стерилизуют 20%-ным раствором гипохлорита натрия (1 ч NaOCl + 5 г воды), четырежды промывают стерильной водой и оставляют на ночь в сушильном шкафу при 27 °С для высушивания. Затем горошины раскладывают на поверхность слоя перлита в чашках Петри и вдавливают в него. Перлит смачивают суспензией изучаемого бактериального изолята (50 мл) с плотностью около 105—106 клеток/мл. В необходимые для сравнения контрольные чашки раскладывают обеззараженные семена гороха и смачивают стерильной водой. После трехдневной инкубации при 22 °С крышки чашек снимают, нижние части чашек с прорастающими семенами ставят в глубокие пластмассовые лотки, аквариумы или другие широкие сосуды, накрытые стеклом или прозрачными пластиковыми крышками, чтобы проростки не подсохли. Через пять дней проводят первую оценку результатов и еще через три дня — вторую. В противоположность контрольным растениям, которые на 8-й день достигают в высоту около 7 см и развертывают третий лист, инфицированные проростки сильно отстают в росте (их высота не превышает 1—2 см), дают большое число побегов (4—5), на них видны признаки метельчатости (ведьмины метлы). Для большей достоверности рекомендуется одновременно инфицировать семена нескольких сортов гороха.
Обнаружение бактериальной зараженности черенков и маточных растений по Хеллмерсу. Бактериозы некоторых культур могут вызывать большие потери в декоративном садоводстве. Поэтому черенки нужно получать только от полностью здоровых маточных растений. Чтобы надежно исключить поражение гвоздики возбудителем бактериального увядания и корневой гнили {Pseudomonas caryophylli), применяют следующую методику: нижние междоузлия тестируемых черенков протирают ватным тампоном, смоченным 70%-ным спиртом с добавлением 0,5% 8-оксихинолинсульфата, и погружают на 20—30 сек в 0,5%-ный раствор сулемы. Для удаления сулемы вновь используют смесь 70%-ного спирта с 0,5%-ным 8-оксихинолинсульфатом. Затем черенки обжигают в спирте, с нижнего конца срезают 0,5—1 см и выбрасывают. От каждого черенка отрезают по 3—4 кусочка длиной 2—4 мм и переносят их в отдельные пронумерованные пробирки, содержащие по 5 мл питательного бульона и 1,5 глюкозы; пробирки инкубируют при 28—30 °С в течение нескольких дней. Оставшиеся части каждого черенка помещают в пробирки с водой, помеченные теми же номерами, что и тест-пробирки. Через 3—6 дней пробирки с бульоном оценивают по развитию бактерий (помутнение среды). Полное отсутствие помутнения показывает, что данный черенок свободен от бактериальной инфекции и пригоден для размножения.
Описанную методику можно применять в видоизмененной форме для проверки маточных растений пеларгонии на зараженность Xanthomonas campestris (патотип Xanthomonas pelargonii). Для поверхностной дезинфекции достаточно двухкратной промывки черенков в крепком мыльном растворе и трехкратного ополаскивания стерильной дистиллированной водой. Затем скальпелем снимают эпидермис, из внутренней части стебля отбирают несколько кусочков ткани, мацерируют их в фарфоровой ступке и переносят в 1 мл дистиллированной воды. Через 3—5 ч суспензию высевают штрихом на питательный агар в чашки Петри и инкубируют в течение нескольких дней при 25—27 °С. Если на агаре появляются цельнокрайные выпуклые блестящие колонии, сначала кремовые, позже желтые, можно с большой вероятностью считать, что материал заражен Xanthomonas campestris pv. pelargonii. Черенки, из которых выделены такие колонии, непригодны для размножения.
Ниже приведен состав сред, применяемых по методике Хеллмерса.
Питательный бульон: пептон — 10 г, мясной экстракт— 10 г, NaCl — 5 г, вода дистиллированная — 1л.
Питательный агар: питательный бульон (pH 7,2) — 1л, агар — 15 г. Добавлением NaOH доводят pH среды до 7,6, нагревают, фильтруют, стерилизуют и, если необходимо, устанавливают pH 7,2 с помощью 1 л НСl. Вместо указанных сред можно использовать стандартизованные готовые питательные среды.