Для подсчета количества и микрораспределения тестаций в почве Бэджес и Николас (Burges, Nicolas, 1961) предложили метод почвенных срезов.
Толщину срезов (около 50 мк) определяли с помощью оптического приспособления к микроскопу; учитывали количество раковинок в поле зрения микроскопа, а отсюда определяли количество организмов в 1 г почвы.
Приведенные три метода — Культуральный и два прямых (стекла Джонса и Моллисона и почвенные срезы) сравнил и подробно анализировал Хил (Heal, 1964). Он ставил культуры на двух необогащенных питательных средах: к 0,5 г навески почвы или мха в чашке Петри (до 10 см) добавляли в первом варианте — почвенную вытяжку (1 объемную часть почвы с одной частью воды; смесь автоклавировали, фильтровали и разводили 4 частями дистиллированной воды), во втором — 1%-ную агаризованную почвенную вытяжку. Культуры исследовали через 1—3 и 11—12 недель. В методику Джонса и Моллисона были внесены небольшие изменения.
Количество раковинок, подсчитанное на стеклах Джонса и Моллисона, было приблизительно вдвое больше полученного методом почвенных срезов. Это объясняется, вероятно, тем, что раковинки Testacida замаскированы в срезах частицами почвы. Поэтому эта методика применима скорее для изучения микроструктуры почвы, чем для распределения и количества тестаций.
Кроме того, метод Джонса и Моллисона позволяет не только подсчитать более эффективно количество организмов, но и отличать мертвые клетки от живых, что необходимо для выяснения
биологической роли Testacida в почвах. Метод, однако, трудоемок, так как максимально было отмечено 26 раковинок на 50 мм2, причем большинство из них оказались пустыми.
Сравнительные данные, приведенные Хилом, показывают, что видовой состав раковинных амеб, обнаруженных тремя методами, не имел существенных различий. Следовательно, необо — гащенные культуры, преимуществом которых является простота и большое количество получаемых организмов, могут дать достаточно точную картину видового состава почвенной фауны раковинных корненожек.
Однако агаризованная почвенная вытяжка благодаря своим физическим свойствам в большей степени имитирует почвенные условия, поэтому здесь чаще встречаются сравнительно мелкие (до 50—80 мк), уплощенные организмы типа Centropyxis и Plagiopyxis, адаптированные к почвенным условиям. В жидкой среде более часты крупные, грушевидные раковинки типа Difflugia, для развития которых необходимы крупные почвенные поры и высокое содержание влаги. Поэтому в практической работе следует использовать как жидкую, так и агаризованную питательные среды.
Боннэ и Тома (Bonnet, Thomas, 1958) разработали употребляемый в настоящее время с небольшими изменениями (Decloitre, 1960) флотационный метод извлечения Testacida из почвы, основанный на продувании почвенной суспензии углекислым газом или воздухом. Приводится схема прибора, предложенного Боннэ и Тома (по Schonborn, 1966). Почвенную суспензию помещают в сосуд, в основании которого находится, крупнопористый стеклянный фильтр. Через трубку в суспензию подают газ. Воронка с коленчатой трубкой и краном служит для регулирования уровня суспензии. Через воронку в пробу при необходимости добавляют воду. Во время флотации краны и закрыты. Увлекаемые потоком газа раковинки концентрируются в поверхностном слое жидкости, которая при открытом кране выплескивается в резервуар. По окончании флотации одновременно прекращается подача газа и закрывается кран. Собравшуюся жидкость переливают в чашку Петри для дальнейшего исследования. Интенсивность потока углекислого газа и время его пропускания, а также вес почвенной пробы для приготовления суспензии регулируют в зависимости от характера почвы и обилия в ней раковинных амеб. Из полученного «концентрата» раковинки выбирают под бинокуляром. Метод применялся Боннэ (Bonnet, 1964) для получения большого количества материала при исследовании видового состава Testacida.
Отфлотированную суспензию можно поместить в чашку Петри с разграфленным на квадраты дном и, зная вес почвы, пересчитать количество раковинок на 1 г почвы (Гельцер, Курганова, 1974).
Куто (Coflteaux, 1967) предложила следующую методику окраски и подсчета раковинных амеб, также основанную на принципе флотации. Фиксируют 250 мг свежей почвы в 1 мл жидкости Буэна — Оллауэна в течение 1—2 дней и окрашивают в 3 мл ксилидинового красного (30 мин.). Затем суспензию разводят водой до 250 мл и через нее несколько часов пропускают сильную струю воздуха. Отобранные с поверхности 5 мл суспензии фильтруют через мембранный фильтр, который вместе с осевшими на нем раковинками заключают в канадский бальзам, где фильтр становится прозрачным и дает возможность подсчитать раковинки под микроскопом.
По Шардэ и Делекур (Chardez, Delecour, 1970), почвенную суспензию (5 г почвы на 100 мл воды), содержащую раковинных амеб, продувают воздухом в течение 5 мин. Для количественного подсчета раковинки собирают пипеткой с горизонтальным капилляром. Из флотационной жидкости изготовляют мазки, и количество тестаций подсчитывают на площади. С помощью сеточки со стороной 3 мм; затем делают пересчет на всю навеску почвы.
Необходимо отметить, что у почвенных форм Testacida размеры раковинки уменьшаются по сравнению с пресноводными формами, наблюдается тенденция к микростомии (уменьшению размеров устья), развитие плагиостомии (смещение устья по плоской вентральной поверхности к переднему концу), или криптостомия (образование приустьевой камеры). У почвенных видов раковинка обычно лишена выростов — шипиков, игл, свойственных водным видам.
Работа с раковинными корненожками требует определенного навыка. Тонко оттянутой пипеткой раковинки под бинокуляром при увеличении 50—100 выбирают из почвенной суспензии и помещают на предметное стекло. Живые организмы изучают в капле воды из той же пробы под покровным стеклом. При помощи препаровальной иглы, изготовленной из энтомологической булавки, осторожно двигают покровное стекло (если организм крупный, оно должно быть на восковых или пластилиновых «ножках»), пока раковинка не займет нужного положения.
При длительном изучении предметное стекло с препаратом амеб помещают во влажную камеру. Если необходимо изолировать животное, покровное стекло сдвигают осторожно в сторону. Рядом с капелькой, в которой оно находилось, капают другую, куда амеба осторожно переводится с помощью препаровальной иглы. Для фиксации и хранения используют 3%-ный формалин или 70%-ный спирт (Schonborn, 1966).
Систематическими признаками раковинных амеб является характер псевдоподий (их форма, величина, наличие или отсутствие ветвления) и строение раковинки.
Иногда приходится исследовать не свежий образец почвы, а доведенный до воздушно-сухого состояния, когда амебная клетка инцистировалась или погибла, при этом раковинка имеет для целей диагностики особое значение. Ее помещают в каплю глицерина и придают препаровальной иглой необходимое положение. Если капелька достаточно мала, раковинку можно рассматривать и двигать под микроскопом и без покровного стекла с объективом 10х и 20х.
Раковинку зарисовывают или микрофотографируют по крайней мере в двух планах — в профиль и с вентральной стороны, обращая внимание на расположение, величину и форму устья. У криптостомных видов оно лучше различимо с дымчатым фильтром, строение раковинки с гиалиновой структурой лучше видно при освещении через зеленый фильтр. С помощью окуляр — и объект-микрометра измеряют диаметр и высоту раковинки и диаметр устья. Постоянные препараты приготавливаются в глицерин-желатине. 7 г желатина в течение двух часов растворяют в 42 мл дистиллированной воды, затем прибавляют 50 г глицерина и 0,5 г кристаллической карболовой кислоты; нагревают на водяной бане и, не дав остыть, фильтруют. Выбранные раковинки одного и того же вида по одной (или при достаточном опыте по несколько организмов) тонко оттянутой пипеткой или специально сделанной из энтомологической булавки «лопаточкой» переносят в свежие капли глицерина, чтобы избавиться от неизбежно попадающих частиц детрита и лишней воды, а оттуда — в глицерин-желатин. Края покровного стекла, закрывающего заключенный в глицерин-желатин объект (с «ножками» По углам), можно покрыть парафином или асфальтовым лаком: к 2 г расплавленного воска прибавляют 7—9 г канифоли, перед употреблением смесь подогревают (Роскин, Левинсон, 1957). Глицерин-желатиновая среда удобна тем, что дает возможность менять положение раковинки нагретой препаровальной иглой.
При изготовлении постоянных препаратов организм (по возможности живой, с хорошо видимой цитоплазмой) промывают в 70°-ном спирте, после чего цитоплазму можно окрасить борным кармином; затем проводят несколько раз через 90°-ный спирт. Если в качестве заключающей среды используют канадский бальзам, перед заливкой необходима проводка через абсолютный спирт и ксилол. Тонкостенные формы типа Euglypha заливают каплей бальзама, предварительно подсушив их на предметном стекле.
Таким образом, работа по ознакомлению с многообразной фауной почвенных простейших для более полного представления о ее составе должна включать в себя целый ряд приемов (метод разведений для жгутиконосцев и инфузорий; чашечный метод Синга — для голых амеб; прямой разбор, флотационный и культуральный методы — для раковинных корненожек), весьма трудоемких и требующих большой затраты времени. Единая методика, обеспечивающая проведение полного протозоологического анализа, еще не разработана, что в значительной степени тормозит развитие почвенной протозоологии.