Учитывая, что лецитин защищает сперматозоиды от температурного шока при температуре выше нуля, свежие пробы следует разбавлять в 10 или 20 раз цитратно-желточным разбавителем или пастеризованным снятым молоком.
В разбавитель следует добавить пенициллин и стрептомицин. Сульфамиды использовать нельзя, так как они вызывают повреждение сперматозоидов во время замораживания и хранения при низких температурах.
Большинство авторов рекомендует перед добавлением глицерина в свежеотобранную и разбавленную сперму охлаждать последнюю в течение 5—6 час до +5°, В конце этого периода разбавленную сперму с температурой +5° надо смешать с равным объемом содержащей глицерин среды, имеющей такую же температуру. При этом следует применять только хорошо очищенный высококачественный глицерин, так как осадки, которые бывают иногда в некоторых сортах глицерина, снижают выживаемость сперматозоидов при хранении их в условиях очень низких температур. Важным усовершенствованием методики является введение в разбавитель, содержащий глицерин, яичного желтка или молока. Это исключает возможность резкого падения содержания липидов и липопротеидов в разбавленной сперме при добавлении глицерина. Точно так же, если в исходный разбавитель входят пентозы или гексозы, на данной стадии эти сахара следует добавлять в соответствующем количестве, чтобы поддержать их концентрацию на первоначальном уровне. Вместе с тем при добавлении глицерина в сперме может повыситься содержание цитрата натрия. В ранних опытах бычью сперму разбавляли до окончательной концентрации глицерина 10 и 15% и цитрата натрия около 3%. В дальнейшем ряд исследователей показал, что наибольший процент сперматозоидов с восстановившейся подвижностью наблюдался при оттаивании спермы в среде, содержащей 6—8% глицерина. Необходимо, однако, всегда иметь в виду, что оптимальная концентрация глицерина зависит от относительного содержания в среде молока или яичного желтка, а также от концентрации цитрата натрия и других компонентов.
Удовлетворительное уравновешивание различных компонентов достигается при содержании в разбавленной сперме 25% яичного желтка, 2% цитрата натрия и 7,5% глицерина. Если же сперму разбавляют молоком, то она должна содержать 10—13% глицерина. Некоторые исследователи предпочитают добавлять разбавитель с глицерином очень медленно, тогда как другие получают одинаково хорошие результаты, добавляя его не постепенно, а сразу. Вероятно, целесообразнее было бы принять своего рода компромиссное решение, а именно разделить весь объем среды с глицерином на три части и вводить их в разбавленную сперму с интервалами в 10 мин, слегка взбалтывая ее при каждом добавлении. Всю процедуру проводят при температуре +5°.