Для выделения и подсчета инфузорий и жгутиконосцев используют широко применяемый в микробиологии метод предельных разведений навески почвы (по Cutler, 1920) жидкой питательной средой (сенной настой с почвенной вытяжкой в соотношении 1 : : 1) и его модификации (Николюк, Гельцер, 1972).
Навеску почвы (Юг) необходимо тщательно подготовить для анализа. Взбалтывания недостаточно для сухих почвенных проб, так как при этом не разрушаются почвенные агрегаты и клетки микроорганизмов не десорбируются с почвенных частиц. Поэтому рекомендуется тщательное растирание почвы, увлажненной до пастообразного состояния жидкой питательной средой (Звягинцев, 1966).
Обычно делают 6 разведений от 1 : 10 до 1 : 1 000 000. Для их приготовления необходима стерильная колба с 90 мл жидкой питательной среды (небольшое ее количество берут для доведения почвы до пастообразного состояния) и 15 пробирок (для 5 разведений в трех повторностях) с 9 мл питательной среды в каждой. В колбу с 90 мл питательной среды помещают подготовленный почвенный образец (первое разведение — 1 : 10), взбалтывают в течение 10 мин., на 30 сек. оставляют для осаждения грубых частиц, из полученной почвенной суспензии делают второе разведение в трех повторностях: стерильной пипеткой берут 1 мл почвенной суспензии и переносят в пробирку с 9 мл жидкой питательной среды (разведение 1 : 100). Затем из этой пробирки стерильной пипеткой переносят 1 мл в следующую пробирку с 9 мл. Всего таким образом делают 5 разведений — от 1 : 100 до 1 : 1 000 000. Сосуды надписывают и помещают в термостат при 22—24° или содержат при комнатной температуре. Микроскопический контроль культур и определение проводят с 3—4-х по 30-е сутки инкубации несколько раз, так как инцистирование и эксцистирование разных видов происходят в разные сроки и одни формы простейших сменяют другие. Для сгущения суспензии и удобства обнаружения организмов в культуре 1—2 мл ее центрифугируют в течение 2—3 мин. на ручной центрифуге. Начинать просмотр следует с последнего, самого большого разведения (1:1 000 000), чтобы не занести клетки пипеткой из более концентрированных разведений. Каплю культуры помещают под покровное стекло для микроскопирования. Для замедления движения организмов (иммобилизации) используют вязкий настой айвовых семечек (4—6 шт. на 10 мл воды) или слабый раствор агар-агара (0,001%).
Количество простейших (по таксономическим группам или по отдельным видам) определяют по таблице, предложенной Мак Крэди для подсчета микроорганизмов (Мс Crady, 1918).
Обнаруживая простейших в определенных разведениях и их повторностях, составляют числовую характеристику, состоящую из трех цифр: первая соответствует числу повторностей — обычно 3. При этом надо отметить, в каком самом большом разведении впервые во всех трех пробирках появились представители данной группы — например, инфузорий. Следующие две цифры числовой характеристики соответствуют числу повторностей, в которых развилась культура в двух разведениях, следующих после отмеченного. Находим вероятное число, соответствующее полученной числовой характеристике. Для получения количества простейших в 1 г почвы это вероятное число умножаем на знаменатель того разведения, где впервые во всех трёх повторностях появилась данная культура. Поясним сказанное на примере:
Разведения: 1:10 1:100 1:1000 1:10 000 1:100 000 1:1000 000. Число повторностей — 3 (первая цифра характеристики), при этом впервые (начиная с разведения 1 : 1 000 000) во всех трех пробирках культура данного организма развилась в разведении 1 : 100. Следующими цифрами характеристики будут: ноль (в разведении 1 : 1000 вообще не развились клетки данных простейших) и единица (в разведении 1 : 10 000 они развились в одной пробирке). Получаем числовую характеристику. В таблице ей соответствует вероятное число 4,0, которое нужно умножить на 100, так как впервые именно в разведении 1 : 100 было отмечено развитие культуры во всех пробирках. Следовательно, количество организмов данной группы в 1 г почвы — 400. Для подсчета общего числа простейших в 1 г почвы числа, полученные для каждой группы, суммируют. При анализе свежей почвы учитывают процент влажности.
Для видового определения необходимо выявление органойдов клетки и её цитологических структур. Для обнаружения этих деталей строения применяют прижизненное окрашивание водными растворами метиленового синего, метиленового зеленого, нейтрального красного и других красителей. Работу ресничек, жгутиков и пищеварительных вакуолей наблюдают в слабых разведениях туши. Фиксированные препараты изготовляют обработкой в течение 1—2 мин. парами осмиевой кислоты (1%-ный водный раствор) или фиксатором Шаудина: насыщенный раствор сулемы (в 1 л дистиллированной воды растворить 70 г сулемы)—2 г; спирт 96°-ный абсолютный — 1 г; фиксатор применяется нагретым до 50—60°. Ядро выявляют окрашиванием 0,1%-ным раствором метиленового зеленого в 1%-ной уксусной кислоте (фиксатор Роскина). Реснички и жгуты окрашивают йодом (несколько капель настойки йода на 10 мл воды). При добавлении 2—4%-ного раствора соды рельефно выступает ресничный аппарат, а также строение рта и глотки. Все обнаруженные формы инфузорий и жгутиконосцев, а также их цисты зарисовывают или микрофотографируют; рисунки выполняют с живых клеток или с препаратов с помощью рисовального аппарата при 900—1500-кратном увеличении.
Используют также метод подсчета простейших, при котором делают последовательный ряд десятичных разведений навески почвы стерильной водопроводной водой. Каплю из каждого разведения высевают в пробирки с питательной средой (сенной настой с почвенной вытяжкой). Посевы культивируют и обрабатывают по общепринятой методике, при этом количество простейших в 1 г почвы принимают равным знаменателю того разведения, в посевах из которых развились культуры простейших (Николюк, 1956).
Оригинальную модификацию метода разведений для подсчета бактериальной и протозойной популяций в почве разработал и описал Дарбишайр с соавторамц (Darbyshire et al., 1974). Обзор количественных методов учета активных почвенных простейших, разработанных советскими протистологами приведен в работе М. С. Гилярова (Gilarov, 1957), доложенной на специальном международном симпозиуме в Генте.
При работе с почвенными простейшими существенным является не только определение общего числа организмов, но и выявление соотношения активных и инцистированных форм. Катлер (Cutler, 1920) предложил обрабатывать параллельную навеску почвы 2%-ной НСl в течение нескольких часов. При этом активные формы погибают, цисты же сохраняют жизнедеятельность. После обработки НСl подсчитывают количество цист, применяя обычную методику. О количестве активных форм в почве дает представление разность между подсчетами по первой и второй навескам. Однако действие НСl, видимо, не столь однозначно, так как иногда после обработки кислотой количество развившихся организмов значительно увеличивается.
Для уничтожения живых клеток используют также нагревание почвенной суспензии до 60—70° (Северцова, 1924).