Одним из начальных условий успешного проведения генетического анализа является овладение методами обнаружения мутаций и накопления возможно большего числа мутаций, касающихся различных признаков и свойств микроорганизмов.
Анализ мутаций является одновременно и методом изучения наследственности.
К морфологическим признакам относятся индивидуальные признаки клетки микроорганизма или частицы вируса: форма, размер, окраска, характер деления, а также внутренняя структура и признаки клона: форма и размер колонии, поверхность колоний. Для анализа метаболических процессов в клетке необходимы биохимические мутации, т. е. мутации, изменяющие метаболизм клетки, изменяющие ее способность синтезировать различные аминокислоты, витамины, основания нуклеиновых кислот, устойчивость или чувствительность к антибиотикам, ядам, к инфекции фагов и вирусов и др. Для учета и выделения мутаций у микроорганизмов были разработаны специфические методы, отличные от таковых для высших животных
Огромное число клеток в культуре микроорганизмов не дает возможности проследить развитие всего потомства. Вместе с тем, очевидно, что для генетического анализа это условие является обязательным. Поэтому одним из основных методов генетического анализа в культуре микроорганизмов является метод клонирования культуры.
Клон бактерии, гриба или водоросли представляет собой вегетативно размноженную культуру из одной клетки с одним ядром или нуклеоидом; клон вируса — потомство от одной вирусной частицы. Если исходная клетка имеет одно ядро или один нуклеоид, то все дочерние клетки имеют один и тот же генотип независимо от количества поколений и числа вегетативно размножившихся клеток. Благодаря этому клон может служить единицей учета генетического расщепления микроорганизмов.
Кроме понятия «клон», в генетике микроорганизмов существует еще понятие «штамм». Этим термином означают генетически однородную культуру со специфическими признаками, поддерживаемую с помощью отбора наследственно однородных клеток как при вегетативном, так и при половом размножении.
Если число ядер или нуклеоидов в клетке два и более и они генетически различаются, то клон распадается на новые клоны соответственно числу различающихся ядер или нуклеоидов. Если суспензию клеток в соответствующем разведении высевают на агаризированную среду в чашки Петри, то через некоторое время на среде образуются отдельные колонии, которые развиваются, как правило, путем деления из отдельных клеток, т. е. являются клонами. Колонии, произошедшие от мутантных клеток, например, с одним нуклеоидом, могут быть обнаружены визуально, если они отличаются от нормальных по каким-либо видимым признакам (форме, размеру или цвету). В том случае, когда клетка имеет два различающихся нуклеоида и в процессе размножения образует колонию, то последняя будет состоять из двух половин разного генотипа. При четырех нуклеоидах, из которых лишь один будет нести отличный генотип, колония окажется секторной: 1/4 одного вида и 3/4 другого.
На этом принципе Э. Виткин разработала метод учета мутаций в клетках Escherichia coli в зависимости от фазы роста культуры этой бактерии. Установлено, что в типичном случае в культуре Е. coli клетки содержат один нуклеоид, в лаг-фазе — два, в логарифмической фазе — четыре. При определенном разбавлении суспензии, анализируя клетки из разных фаз культуры по характеру колоний на плотных средах и размеру сектора, можно судить о возникновении мутаций в нуклеоидах, поскольку они являются гаплоидными.
Схема выявления мутантного нуклеотида по размеру сектора колонии
Дана схема выявления мутантного нуклеоида по размеру сектора в колонии. Как видно из схемы, в первом случае клон состоит из однородных клеток, во-втором — мутация произошла в одном из двух нуклеоидов, и половина клона состоит из мутантных клеток, в третьем — мутация возникла в одном из четырех нуклеоидов. Таким путем было показано, что метод клонирования дает возможность анализировать генотипы бактериальной культуры. Однако указанный метод легко применим лишь в том случае, когда изучаемые мутантные или рекомбинантные клетки имеют морфологические отличия от нормальных (размер, форма и окраска колоний).
Метод обнаружения биохимических мутаций у микроорганизмов был предложен Г. Бидломи Е. Татумом, (клонов) с биохимическими мутациями, вызывающими утрату способности к синтезу каких-либо аминокислот, витаминов или оснований нуклеиновых кислот, производят путем проверки их способности расти на минимальной среде. Минимальной называется среда, в которой содержатся только соли и сахара. Многие микроорганизмы дикого типа могут расти на минимальной среде, так как они сами способны синтезировать нужные для своего роста метаболические вещества (аминокислоты, витамины, основания нуклеиновых кислот). Такие микроорганизмы называют прототрофными.
При наследственной утрате способности синтезировать какой-либо из метаболитов для роста микроорганизма необходима добавка этого метаболита в питательную среду. Среда, в которую добавлен возможно полный набор метаболитов (аминокислот, витаминов, оснований), называется полной. Микроорганизмы, нуждающиеся для своего роста в каких-либо компонентах полной среды, называют ауксотрофными. Поэтому иногда биохимическими мутациями у микроорганизмов называют наследственные изменения от прототрофного к ауксотрофному типу питания (прямые биохимические мутации).
Для выделения мутантных клонов, не способных синтезировать необходимые для своего роста вещества и в силу этого неспособных к росту на минимальной среде, анализируемую смесь клеток высевают на полную среду, и от каждой выросшей на ней колонии делают отсевы на две питательные среды: полную и минимальную. В этом случае из клеток с генотипом дикого типа, т. е. не нуждающихся для своего роста в веществах полной среды, разовьются колонии на минимальной среде. Из мутантных клеток, которые утратили свойство синтезировать какое-либо из необходимых для своего роста веществ, на минимальной среде колонии не разовьются. Таким образом, одновременная проверка клонов на двух разных средах позволяет выявить биохимические мутации.
Но проверка каждой колонии в отдельности требует много времени, так как биохимические мутации — довольно редкое явление. Дж. Ледерберг предложил усовершенствованный метод выделения биохимических мутаций у микроорганизмов — метод отпечатков (replica plating). Для облегчения пересева колоний, применяют специальную печатку, имеющую размер чашки Петри. Плоскость печатки покрывают бархатом. Сначала к печатке с бархатом прикладывают чашку с анализируемыми колониями, выросшими на полной среде. На ворсинках бархата остаются клетки отдельных колоний. Затем к этой печатке прикладывают две чашки — с минимальной и полной средой. После инкубации таких отпечатков сопоставляют колонии, выросшие на полной и на минимальной среде. Практически это делают таким образом: чашку с минимальной средой ставят на чашку с полной средой так, чтобы идентичные колонии совпали. Просматривая две совмещенные чашки в проходящем свете, на чашке с полной средой отмечают колонии, которые не выросли на минимальной среде. Это дает возможность обнаружить мутантные колонии.
Метод отпечатков для выделения биохимических мутаций у микроорганизмов
Далее из мутантной колонии, выросшей на полной среде, делают отсевы на специальные среды, содержащие 1) только аминокислоты, 2) только витамины и 3) только основания нуклеиновых кислот. Колонии, не выросшие на одной из этих трех сред, относятся к мутантам, нуждающимся в одном из трех типов метаболитов. В дальнейшем проводят испытание на потребность в отдельном метаболите: определенной аминокислоте, витамине и т. д. Так обнаруживают прямые биохимические мутации у микроорганизмов.
Для выделения биохимических мутаций широко применяют также и метод частичного обогащения питательной среды. При этом к минимальной среде прибавляются в очень малых концентрациях компоненты полной среды. Высеянные на такую среду клетки дикого типа, не нуждающиеся в веществах полной среды, дают начало колониям нормального размера. Биохимические мутанты, не растущие на минимальной среде, использовав необходимые им вещества в частично обогащенной питательной среде, прекращают рост и в результате образуют мелкие колонии. По этим мелким колониям можно отобрать мутантные.
Существуют также специальные методы концентрирования биохимических мутантов с целью уменьшения затрат времени и труда на их выявление. Сущность одного из них заключается в том, что к суспензии клеток в жидкой минимальной среде прибавляют aнтибиотик пенициллин.
Установлено, что пенициллин поражает только делящиеся клетки. Так как в минимальной среде нормально размножаются клетки только дикого типа, то они в основном и поражаются. Не размножающиеся на минимальной среде биохимические мутанты не поражаются. Затем клетки отмывают от пенициллина и высевают на полную среду в чашки Петри. Так как большая часть клеток дикого типа была убита пенициллином, то среди вырастающих колоний на полной среде относительное количество колоний биохимических мутантов оказывается увеличенным. Из выросших колоний делают отпечатки на минимальную среду и выделяют мутанты.
Для учета обратных биохимических мутаций, т. е. от ауксотрофного к прототрофному типу, применяют метод селективных сред. Селективной называется полная среда без какого-либо определенного метаболита, на которой могут расти лишь клетки определенного генотипа. На такой среде из большой популяции клеток отбираются единичные мутантные клетки. Например, высевая культуру кишечной палочки Е. coli, нуждающуюся в витамине — биотине, на среду, лишенную его, можно отбирать мутации, восстанавливающие способность синтезировать биотин, так как к росту способны только клетки, претерпевшие обратные мутации, т. е. возвратившие способность синтезировать биотин. Среда, лишенная биотина и, следовательно, не пригодная для роста прямой мутантной формы, может служить селективной для обнаружения обратных мутаций.
Кроме обратных биохимических мутаций, методом селективных сред легко обнаруживаются также мутантные клетки, устойчивые к различным ядовитым веществам и антибиотикам. Для этого суспензию клеток высевают на среду, содержащую, например, один из антибиотиков (пенициллин, стрептомицин и др.). Все нормальные клетки, чувствительные к антибиотику, гибнут, а размножившиеся оказываются мутантными — устойчивыми к данному антибиотику и поэтому дают колонии. Зная исходное разведение суспензии клеток, можно подсчитать концентрацию мутантов в исходной популяции.
Однако при этом может возникнуть сомнение, действительно ли на селективных средах выявляются уже существовавшие мутации. Быть может, вырастающие колонии приобретают устойчивость вследствие прямой адаптации части клеток к антибиотику, добавленному в питательную среду. Решить этот вопрос позволяет тот же метод отпечатков. Например, если вырастить культуру бактерий в чашке со средой без антибиотика, а затем сделать с такого посева ряд отпечатков на чашки с селективной средой, содержащей антибиотик, то на каждой чашке вырастут единичные колонии, устойчивые к антибиотику. При этом расположение этих колоний оказывается идентичным на всех чашках. Если из соответствующих этим колониям мест исходной культуры взять клетки для испытания на среде с антибиотиком, то все они оказываются устойчивыми к нему. Следовательно, они обладали этим свойством еще до контакта с антибиотиком, и селективная среда лишь выявила уже имевшиеся в популяции устойчивые мутантные клетки.
Нужно заметить, что сам принцип селективных сред не является для генетики и селекции новым. Принцип селективных сред базируется на методе отбора мутантов на провокационном фоне, которым издавна пользовались селекционеры. Например, И. В. Мичурин широко применял отбор сеянцев плодовых растений на провокационном фоне. Обычно этим методом пользовались при отборе растений, устойчивых к различным заболеваниям, морозоустойчивых и т. д. В генетических работах с микроорганизмами принцип отбора на провокационном фоне получил блестящее развитие.
Описанные приемы не исчерпывают всего разнообразия методов учета и выделения мутантов у микроорганизмов.
В качестве примера, показывающего разнообразие мутаций, выделенных с помощью указанных методов, могут служить мутации у Е. coli.
Мутации E. coli
Анализ биохимических мутантов у различных групп микроорганизмов — бактерий, грибов, водорослей — показал наличие у них сходного спектра мутаций.