Приготовления простых препаратов часто бывает недостаточно для обнаружения бактерий в светлом поле микроскопа.
В этом случае применяют иную методику микроскопических исследований (как правило, фазово-контрастную) или окрашивание бактерий.
Приготовление и окрашивание мазка. Использование фазово-контрастной методики предполагает наличие соответствующего микроскопа и приготовление свежих препаратов. Окрашивание состоит из следующих этапов.
Приготовление мазка. Раздавленный растительный материал (пораженная ткань) или культуру микроорганизмов с помощью петли переносят в каплю водопроводной воды на обезжиренном предметном стекле (для обезжиривания стекла выдерживают в хромпике или протирают бензином, ксилолом, смесью соляной кислоты со спиртом) и растирают равномерно по площади 3X1,5 см. При этом надо следить за тем, чтобы плотность бактериальной суспензии была не выше необходимой для слабого помутнения.
Воздушная сушка и фиксация. Полученный мазок высушивают на воздухе и фиксируют путем нагревания. Для этого предметное стекло берут пинцетом или каким-нибудь держателем и мазком вверх трижды медленно проводят через светящуюся часть пламени бунзеновской горелки.
Окрашивание. После фиксации предметное стекло кладут горизонтально на планшет для окрашивания и каплями наносят на мазок фильтрованный раствор соответствующего красителя. Красящий раствор должен покрывать все предметное стекло.
Методы окрашивания и красители. Для быстрого окрашивания бактериальных мазков пригодны основные анилиновые красители. Особенно рекомендуется окрашивание метиленовой синью по Лёффлеру. Вначале готовят насыщенный спиртовой раствор красителя, который можно хранить длительное время. Непосредственно перед окрашиванием 30 мл этого раствора смешивают с 70 мл 0,01%-ного раствора КОН. Время окрашивания составляет 5—8 мин.
При окрашивании карболфуксином по Цилю и Нильсену используется насыщенный спиртовой раствор основного фуксина. Для приготовления красящего раствора 1 часть маточного раствора смешивают с 5%-ным раствором фенола. Время окрашивания — 0,5—1 мин.
Удаление красящего раствора и очистка мазка. После окончания окрашивания красящему раствору дают стечь с предметного стекла, остатки смывают водопроводной водой. Мазок высушивают на воздухе или удаляют капельную жидкость фильтровальной бумагой. Следы красителя на рабочем столе или на руках можно удалить подкисленным спиртом.
Наблюдение. Окрашенные препараты рассматривают с применением иммерсионных объектов с высокой апертурой. Для этого пригодны ахроматы и апохроматы с увеличением 90 X — 100 X или аналогичные объективы. В качестве иммерсионной жидкости используется имеющееся в продаже иммерсионное масло с показателем преломления 1,515.
На окрашенных препаратах определяют: наличие бактерий в препарате; форму бактериальных клеток (округлая, палочковидная, нитевидная и др.); размеры клеток (длина, ширина); вид агрегации (отдельные клетки, группы, зооглеи и т. д.).
Окрашивание по Граму. При идентификации многих фитопатогенных бактерий решающим показателем является окрашивание по Граму. Этот дифференцирующий признак основан на различиях в строении оболочки бактериальных клеток. К грамположительным прежде всего относятся виды Corynebacterium, в то время как большинство других фитопатогениых бактерий реагирует на окрашивание отрицательно. Методика окрашивания состоит в следующем.
— Приготовление мазка на обезжиренном предметном стекле, его высушивание на воздухе и фиксирование нагреванием.
— Нанесение на мазок капли карболового раствора генцианвиолета (торговый препарат или 10 мл насыщенного спиртового раствора генциан-виолета + 90 мл 2,5%-ного фенола), инкубация в течение 2—5 мин.
— Сливание красящего раствора и нанесение на предметное стекло раствора Люголя (торговый препарат или 2 г KI растворить в небольшом количестве дистиллированной воды, добавить 1 г йода и довести объем до 300 мл).
— Промывка 96%-ным спиртом (в химическом стакане) до полного исчезновения следов краски.
— Высушивание (иногда не проводится).
— Контрастное окрашивание карбол-фуксином (маточный раствор или его разведения) в течение 1—2 сек. Карбол-фуксин можно заменить 1%-ным сафранином, увеличив время окрашивания до 3—5 мин.
Далее препарат тщательно промывают в водопроводной воде и высушивают на воздухе.
Результаты окрашивания по Граму можно установить только при хорошем освещении (принцип освещения по Кёлеру), используя иммерсионный объектив и полностью открыв диафрагму. Грамположительные микроорганизмы окрашиваются в темно-синий цвет, грамотрицательные — в бледно-розовый или светло-красный.
Примечание. Для контроля качества окрашивания, подбора концентраций красящих растворов и времени окрашивания настоятельно рекомендуется использовать какой-либо вид бактерий с четко выраженной грамположительной реакцией, например Escherichia coli.
Окрашивание жгутиков. При диагностике бактерий ключевую роль играет форма жгутиков. Их расположение и число можно определить с помощью электронного микроскопа или специального окрашивания. Из-за особой сложности этого процесса разработаны различные способы окрашивания жгутиков. Почти всегда после фиксирования препарата проводят специальную обработку каким-нибудь протравливающим раствором (как правило, содержащим таннин), который вызывает набухание белка жгутиков. Лишь затем приступают к окрашиванию.
Из имеющихся методов в качестве примера приведен относительно простой, но широко применяющийся вариант окрашивания по Лейфсону. Для ознакомления с другими методами окрашивания, например по Пепплеру, Грею, Лёффлеру, можно обратиться к специальной литературе.
Для окрашивания жгутиков используют молодые культуры бактерий, развивавшиеся от 8 до 24 ч при температуре, оптимальной для данного вида (25, 28, 32 или 37 °С). На обезжиренное предметное стекло наносят тонкий мазок, затем на еще влажный препарат — каплю свежеприготовленного и отфильтрованного раствора следующего состава: 1,5%-ный NaCl — 20 мл, 3%-ный таннин — 20 мл, 1,2%-ный спиртовой раствор парароз1аанилина — 20 мл. Далее препарат подсушивают на воздухе.
Время окрашивания — 20—30 мин. Препараты просматривают с иммерсионными объективами (апохромат или ахромат 20X или 100 X) при хорошем освещении. Вместо парарозаанилина можно использовать 1,2%-ный спиртовой раствор фуксина.
Определение подвижности. Признак подвижности имеет особое значение при дифференциации бактериальных возбудителей болезней. Для его определения рекомендованы следующие методы.
1. Небольшое количество исследуемой культуры переносят петлей в каплю водопроводной воды на чистом покровном стекле, которое затем кладут каплей вниз на предметное стекло с шлифованной лункой или на стеклянное кольцо, приклеенное к предметному стеклу. Этот способ носит название «наблюдение в висячей капле»,
2. Из свежей культуры готовят простой микроскопический препарат и рассматривают его при среднем увеличении (объектив 20Х или 40Х) и хорошем освещении. При этом микроскоп фокусируют на край капли и медленно передвигают препарат к ее середине. Вблизи краевой зоны подвижность бактерий видна лучше всего, причем подвижными можно считать только те бактерии, которые совершают направленное или вращательное движение. Дрожание почти на одном месте вызвано броуновским движением молекул и часто встречается у неподвижных бактерий.
Определение спорообразования. Выделив грамположительные бактерии, часто приходится устанавливать, способны ли они к спорообразованию. Как правило, спорообразующие бактерии не являются возбудителями болезней. Признак спорообразования можно установить физиологическим путем (по устойчивости спор к высокой температуре) или с помощью микроскопических препаратов.
Тест с нагреванием. Из двух-трехдневной культуры на косом агаре небольшую порцию исследуемого материала переносят в пробирку с 3 мл питательного бульона (pH 7,0), пробирку помещают на 10 мин в водяную баню при 70—80 °С и затем инкубируют при 28 °С в течение 24 ч. Контролем служит пробирка с инокулированным, но непрогретым бульоном. Если после инкубации появляется отчетливое помутнение бульона, исследуемая бактерия относится к числу спорообразующих.
Микроскопическое определение спорообразования. Споры в бактериальных клетках можно обнаружить в окрашенных препаратах. Во многих случаях для этого достаточно окрашивания метиленовой синью или карболфуксином, а также по Граму, но есть и специальные методы окрашивания спор.
1. Окрашивание по Виртцу: подсушенный на воздухе и фиксированный нагреванием мазок покрывают 5%-ным раствором малахитовой зелени, затем осторожно нагревают предметное стекло над пламенем горелки до полного испарения красителя.
Добавление и испарение красителя повторяют несколько раз до появления пленки с металлическим блеском. Избыток краски смывают 2—3 мин под струей водопроводной воды. Затем препарат помещают в стакан с водой еще на 4—5 мин. После высушивания на воздухе или фильтровальной бумагой проводят контрастное окрашивание 10%-ным раствором сафранина (10 мин), вновь промывают препарат водопроводной водой, осторожно обсушивают и просматривают с масляной иммерсией. Споры окрашиваются в зеленый цвет, вегетативные части клетки — в красный.
2. Окрашивание по Мёллеру: высушенный на воздухе и фиксированный теплом мазок покрывают карболфуксином, нагревают над слабым пламенем горелки до образования пузырьков и промывают 96%-ным спиртом до полного удаления остатков красителя. После промывания водопроводной водой и подсушивания препарат контрастно окрашивают метиленовой синью (1 часть маточного раствора и 9 частей дистиллированной воды) и просматривают с масляной иммерсией. Споры окрашиваются в красный цвет, вегетативные части клеток — в синий.
Более подробные описания методов окрашивания приведены в специальной литературе.