Микроскопия — это исследование объектов с помощью особых увеличительных приборов — микроскопов.
Для получения увеличенных изображений в микроскопах используют проходящее или отраженное от объекта квантовое излучение различного вида (видимого диапазона, ультрафиолетовое или рентгеновское), а также потоки элементарных частиц (поток электронов). Поэтому существует несколько разновидностей микроскопического метода: световая, ультрафиолетовая, рентгеновская, электронная микроскопии. Наиболее распространены в цитологии и гистологии световая и электронная микроскопии.
Методы микроскопирования позволяют наблюдать и изучать только такие объекты или их структуры, размеры которых превосходят половину длины волны излучения, используемого в конкретном методе. Таким образом, основной характеристикой любого микроскопа является значение его предельного разрешаемого расстояния d (разрешающая способность, или разрешение).
Разрешение — это наименьшее расстояние между двумя точками объекта, при котором они видны раздельно; наименьший размер объекта, при котором микроскоп еще «разрешает» рассмотреть детали изображения.
Теоретически предельная разрешающая способность выражается формулой, из которой следует, что чем короче длина волны излучения, используемого в микроскопе, тем выше его разрешение и, следовательно, больше максимальное увеличение. Разрешение светового микроскопа равно 0,25 мкм, так как средняя длина волны кванта света видимого диапазона равна 0,5 мкм, что позволяет увеличивать изображение в 1500 раз.
В электронном микроскопе длина волны потока электронов равняется 0,000005 мкм, поэтому он позволяет рассматривать объекты, размеры которых в 100 000 раз меньше, и практически достигать увеличений в 1 000 000 раз.
Объект в микроскопах может освещаться двумя основными способами: излучение проходит через него или отражается. В первом случае исследуют внутреннюю структуру, во втором — поверхность объекта.
Микроскопы, в которых используют разные способы освещения, значительно различаются по конструкции и имеют разные названия: просвечивающие (трансмиссионные) — микроскопы проходящего света; микроскопы отраженного света — сканирующие (растровые).
Наиболее часто в клинической и экспериментальной практике применяют световой микроскоп, позволяющий изучать гистологические препараты в проходящем свете и светлом поле.
При световой микроскопии для достижения специальных цепей применяют и другие методы изучения и наблюдения гистологического препарата. Эти методы реализуют с помощью дополнительных приставок и устройств к обычным биологическим микроскопам или с помощью специализированных микроскопов.
Широко используют метод темного поля, когда объект освещается только косым светом с боковых сторон, поэтому детали объекта контурно выделяются на темном фоне.
Метод фазового контраста предполагает, что объект освещают два луча со сдвинутой на четверть длиной волны фазы. Проходя через объект с разных сторон и дополнительно сдвигаясь по фазе структурами препарата, эти лучи в области первичного изображения скрещиваются. Вследствие интерференции происходит сложение или вычитание их амплитуд, что выражается в сильном изменении яркости структур объекта и сильном повышении его зрительного контраста.
Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия основана на флюоресценции — вынужденном свечении некоторых веществ, входящих в состав клеточных и тканевых структур, при освещении их лучами света с короткой длиной волны (первичная флюоресценция) или на флюоресценции специальных люминесцентных красителей (флюорохромов), которыми окрашивают препарат (вторичная люминесценция). При этом возбуждающий люминесценцию свет задерживается специальным (запирающим) фильтром окуляра и флюоресценция становится видна в поле зрения микроскопа. Этот метод позволяет выявлять не только невидимые с помощью других методов структуры клеток и тканей, но и судить об их качественном химическом составе.
Поляризационная микроскопия основана на способности некоторых веществ клеток и тканей вращать плоскость поляризации световых лучей. Объект освещают поляризованным светом, прошедшим через поляризационный фильтр. Перед окуляром ставят второй поляризационный фильтр (анализатор), располагая его плоскость поляризации перпендикулярно первому фильтру (поляризатору). Свет не пройдет в окуляр, но если в плоскости поля зрения находятся структуры, например коллагеновые волокна, способные вращать плоскость поляризации световых лучей (обладающие анизотропией), их изображение можно наблюдать. По особенностям изображения поляризационная микроскопия напоминает темнопольную.
Изображение регистрируют фото — и видеокамерами, в том числе и цифровыми, позволяющими вводить изображение в компьютер и обрабатывать его электронными методами с последующим выводом на экран монитора или распечатывать.
При электронной микроскопии источник света заменен источником электронов (электронная пушка), с помощью высокого напряжения (100 000 В) разогнанных до большой скорости. Электроны, прошедшие через изготовленный по особым методикам препарат, находящийся в вакууме, фокусируются не стеклянными, а электромагнитными линзами, играющими роль объектива и окуляра, и проецируются на экран, покрытый люминофором. Подобно экрану телевизора под действием электронов он светится в видимом диапазоне, позволяя видеть увеличенные в сотни тысяч раз структуры объекта. Если узкий электронный луч не проходит через препарат, а последовательно пробегает (сканирует) его поверхность, в результате чего образуется трехмерное изображение, то данная разновидность электронного микроскопа называется растровой (сканирующей).
В большинстве случаев, чтобы сделать объект пригодным для морфологического исследования с помощью микроскопа, ткани и органы подвергают сложной предварительной подготовке, в результате которой получают цитологический препарат.
Цитологический препарат может быть временным, если он служит для одномоментного исследования и не предназначен для длительного хранения, и постоянным, который делают с расчетом на многократное повторное изучение и сохраняют неопределенное время.
Для качественных исследований в цитологии используют различные цито — и гистохимические методы, которые позволяют установить локализацию определенных веществ или биохимических процессов в тканевых и клеточных структурах.
Цитохимические реакции чаще всего проводят на криостатных (приготовленных с помощью замораживающего микротома) срезах. О локализации исследуемого вещества судят по отложению окрашенного продукта реакции. Например, для выявления в клетках ДНК и РНК применяют реактив Фельгена, который дает с нуклеиновыми кислотами розово-фиолетовую окраску. Гликоген выявляют с помощью ШИК-реакции (реактив Шиффа и йодная кислота), продукты которой имеют ярко-малиновую окраску.
Разновидностью гистохимического исследования является иммуногистохимическая методика, принцип которой основан на специфическом взаимодействии меченых антител (АТ) с тканевыми антигенами (АГ). Для мечения антител применяют люминесцентные красители (флюорохромы), а также ферменты (пероксидазу хрена) или электронно-плотные частицы для электронной иммуногистохимии (коллоидное золото). При прямом методе меченые антитела непосредственно взаимодействуют с антигенами, при непрямом методе немеченые (первые) антитела специфически и взаимодействуют с антигенами ткани, меченые (вторые) взаимодействуют с немечеными (первыми) антителами, которые для вторых антител являются антигеном, что значительно повышает чувствительность метода.
Из других качественных методов следует упомянуть об авторадиографии, которая позволяет изучать процессы метаболизма в т метках и тканях с помощью радиоактивной метки, включенной в состав биологического субстрата, используемого клеткой. Место локализации метки можно обнаружить по почернению фотоэмульсии, которой покрывают препарат.
Гибридизацией in situ изучают локализацию генов и их экспрессию. С помощью короткого отрезка меченой нуклеиновой кислоты можно найти и пометить соответствующую ей последовательность нуклеиновых кислот в клетке. Локализацию метки, по которой судят о локализации или экспрессии исследуемого гена, обычно выявляют радиоавтографическим методом. С помощью гибридизации можно специфически выявить очень малые концентрации синтезируемых клеткой веществ.
Количественные методы в гистологии необходимы для получения объективных данных об изменениях клеточных структур в норме, в эксперименте или при патологии. Основные количественные показатели структурных компонентов клеток и тканей — это морфометрические (число структур и их геометрические размеры) и денситометрические (отражающие концентрацию, оптическую плотность химических веществ в этих структурах) параметры. Для их выявления применяют морфометрические и спектрофотометрические методы.
Морфометрический метод включает совокупность приемов и методов определения геометрических характеристик исследуемых объектов. Число структур, их площади, диаметры, периметры и другие показатели измеряют с помощью специальных морфометрических сеток, курвиметра и метода вычисления весовых соотношений путем взвешивания. Микроструктуры в световых микроскопах измеряют с помощью окуляр-микрометра или вставляемых в окуляр морфометрических сеток. Также морфометрию проводят по изображениям исследуемых объектов на фотографиях. Морфометрический анализ в последние годы усовершенствовали за счет внедрения компьютерных методов. С помощью цитоспектрофотометрии определяют химический состав, концентрацию и количество различных веществ, содержащихся в конкретных структурах клеток и тканей с помощью специальных приборов цитоспектрофотометров. Они регистрируют спектры поглощения или излучения участков цитологического препарата и по их интенсивности судят о количественном содержании исследуемых веществ.