Бактериальные возбудители часто присутствуют в исследуемом материале в небольшом количестве или вместе с сопутствующей сапрофитной микрофлорой.
В обоих случаях прямое выделение не даст результатов или приведет к ошибочным выводам. Поэтому целесообразно концентрировать изолируемые микроорганизмы и тем самым повысить вероятность их выделения.
Накопление путем механического отделения. Для накопления бактерий путем механического отделения от растительной ткани можно использовать, например, центрифугирование мацерата этой ткани. Надосадочную жидкость осторожно сливают, осадком инокулируют чашки с агаризованной средой.
Накопление с помощью селективных сред. Этот метод позволяет затормозить или полностью подавить развитие сопутствующей микрофлоры, не влияя отрицательно на изолируемые бактерии, а часто даже стимулируя их. Селективные среды находят в фитобактериологии все большее применение. В качестве примера приведены методики выделения возбудителей мокрой гнили из группы Erwinia carotouora, ожога плодовых культур Erwinia amylovora и пятнистости листьев типа Pseudomonas syringae.
Выделение возбудителей мокрой гнили из группы Erwinia carotovora. Для выделения патогенов этого типа разработаны различные селективные среды, две из них описаны ниже.
1. Приготовленную серию последовательных разведений исследуемого материала шпателем наносят на поверхность галлолактозного агара. После инкубации в течение 2—5 дней при 28 °С появляются колонии. Плоские, беловато-серые сверху и слегка красноватые снизу колонии с большой вероятностью указывают на присутствие в пробе клеток Е. carotovora. Окончательное заключение можно сделать после проведения теста на патогенность. При некотором навыке колонии Е. carotovora можно отличить по их характерному виду от сопутствующих непатогенных микроорганизмов в чашках Петри.
2. Значительно более специфична при выделении пектолитически активных возбудителей типа Е. carotovora среда по Стюарту. Она представляет собой двойной слой агара, где базальным субстратом является следующая смесь: пептон — 15 г, таурохолат натрия — 3,75 г, NaCl — 3,75 г, лактоза — 7,50 г, нейтральная красная (1%-ный водный раствор) — 5,2 мл, CaCl2 — 4,0 г, агар — 15,0 г, вода дистиллированная — 750 мл. Среду стерилизуют 10 мин при 110 кПа и разливают в чашки Петри, где она застывает.
Базальный субстрат покрывают тонким слоем второй среды. Для ее приготовления 2 г полипектата натрия суспендируют в 6 мл этанола и, добавляя раствор 0,1 г ЭДТА в 100 мл дистиллированной воды, доводят объем до 100 мл; pH среды — 7,4. Полученный субстрат стерилизуют 1 мин при 110 кПа. На этой среде пектолитически активные штаммы Е. carotovora формируют типичные мелкие, слизисто-блестящие колонии, расположенные в центре воронкообразного углубления. Последние образуются вследствие выделения ферментов, действующих на верхний пектиновый слой.
Выделение возбудителя ожога плодовых. Хаан описал новый субстрат для выделения возбудителя ожога плодовых Erwinia amylovora: питательный агар — 37 г, сахароза — 100 г, крототан — 50 мг, бенлат — 50 мг, пол-террафун — 250 мг, трифенилтетразолхлорид (0,5%-ный водный раствор) — 10 мл, вода дистиллированная — 1л. Крототан, бенлат и пол-террафун добавляют в виде водных растворов после остывания среды примерно до 60 °С. На этой среде (нанесение пробы штрихом, кусочком ткани или слизи) Е. amylovora после инкубации при 28 °С в течение 48 ч образует легко отличимые красноватые выпуклые колонии.
Для выделения этого возбудителя также разработано много других селективных сред, составы которых можно найти в специальной литературе.
Выделение флуоресцирующих псевдомонад. Флуоресцирующие виды Pseudomonas, к которым относятся и некоторые патогены, например Ps. syringae, можно довольно легко выделять на следующей среде: протеазо-пептон — 20,0 г, глицерин — 8,0 мл, K2SO4 — 1,5 г, MgSO4 · 7H2O — 1,5 г, агар — 15,0 г, дистиллированная вода — 940 мл; pH среды доводят до 7,2. Среду стерилизуют 15 мин при 121 °С и после охлаждения примерно до 60 °С добавляют 60 мг/л пенициллина, 50 мг/л новобиоцина и 100 мг/л актидиона. Время инкубации — 48 ч при 28 °С. Результаты оценивают при УФ-освещении: флуоресцирующие колонии относятся к группе Pseudomonas. Дальнейшая их идентификация проводится серологическим методом или с помощью теста на патогенность.
Накопление бактерий путем пассажей на растениях-хозяевах. Иногда фитопатогенные бактерии настолько тесно связаны со вторичными микроорганизмами (например, возбудитель мокрой гнили картофеля Erwinia carotovora var. atroseptica), что непосредственно выделить их из пораженной ткани не удается, для этого необходимо накопление путем пассажа через растение-хозяина. Этот метод описан на примере возбудителя мокрой гнили картофеля.
Клубни картофеля тщательно моют, поверхностно стерилизуют путем обработки раствором сулемы или погружением в 60— 70%-ный спирт и разрезают на половинки или ломтики. Из мацерата ткани, пораженной мокрой гнилью, готовят ряд последовательных разведений. Полученную суспензию пипеткой наносят на половинки или ломтики клубней таким образом, чтобы они были полностью покрыты ею. После инкубации в термостате при 20 °С в течение двух суток определяют поражение тканей мокрой гнилью. Пораженные ткани размягчаются, здоровые части клубней прочности не теряют. Если кашицу размягченной ткани нанести штрихом на поверхность агаровой среды, можно получить колонии чистого изолята.
Другой пример накопления патогенных бактерий путем пассажей — это тест на растениях баклажана для выделения Corynebacterium sepedonicum, возбудителя кольцевой гнили картофеля. В качестве индикаторов используют молодые растения баклажана сортов Black Beauty и Frtihviolette, выращенные при 22—25 °С из протравленных семян. После появления первого настоящего листка проростки пикируют в горшки диаметром 9 см и выращивают при 20—22 °С. Заражение проводить лучше всего в фазе 2—3 настоящих листьев, когда побеги достигают диаметра 1,5 мм. Бактериальную суспензию вводят шприцем с очень тонкой иглой в верхушки стебля, каждой пробой инфицируют не менее 10 растений. При температуре инкубации 20—25 °С бактерии довольно активно размножаются в растениях баклажана. Симптомы заражения — одностороннее увядание, пожелтение, деформация листьев — появляются через 15—35 дней после инфицирования в зависимости от концентрации исходной суспензии. Для контроля в несколько растений вводят безвредную для них стерильную воду.
Эту же методику можно использовать для обнаружения латентного поражения кольцевой гнилью.