Если на основании определенных симптомов на растениях и по результатам микроскопического исследования возникло предположение, что возбудителем болезни является бактерия, следующим шагом должно быть ее выделение.
При этом исходят из того, что возбудитель загрязнен сопутствующими организмами, т. е. налицо смешанная популяция. Чтобы получить возбудителя в виде отдельной растущей колонии, мацерат ткани следует посеять на среду штрихом.
Посев штрихом. Прокаленной инокуляционной петлей берут небольшое количество содержащего бактерии мацерата растительной ткани и легкими движениями, не повреждая поверхности агара, наносят на подготовленную питательную среду 4—6 штрихами. Повторно прокалив петлю, чашку со средой поворачивают на 90° вправо и затем от второго штриха наносят еще 4—6 штрихов, вновь прокаливают иглу и проводят третий посев. Этим достигается такое разведение исходного материала, при котором бактерии после инкубации в термостате в течение 48—72 ч при 28 °С формируют отдельные колонии различной формы и окраски. Затем колонии переносят для дальнейшего исследования в пробирки с косым агаром. Прокаленной петлей берут колонию и осторожным движением в виде змейки или зигзага наносят на питательный агар.
Метод разлива в чашки по Коху. Метод разлива в чашки по Коху обеспечивает формирование каждой колонии из одной единственной бактериальной клетки. Лучше всего приготовить из исходного материала суспензию в стерильной воде и применять метод Коха только с этим разведением. Небольшое количество суспензии переносят в первую пробирку с питательной средой, охлажденной до 60 °С. Затем содержимое пробирки перемешивают с инокулюмом, вращая ее между ладонями. Далее, берут вторую пробирку, осторожно открывают над пламенем горелки и большими петлями переносят в нее из первой пробирки три порции субстрата. Содержимое пробирки после обжига горлышка и пробки выливают в первую чашку Петри, приоткрывая крышку чашки ровно настолько, чтобы ввести под нее горлышко пробирки. Сразу после выливания чашку закрывают и осторожными движениями равномерно распределяют питательную среду.
Тщательно перемешав содержимое второй пробирки, берут третью пробирку и петлей переносят в нее из второй шесть порций субстрата. Содержимое пробирки выливают в чашку, а содержимое пробирки после перемешивания — в чашку. Чашки со средой инкубируют в термостате при 28°С, через несколько дней содержавшиеся в исходном материале бактерии формируют колонии.
Последовательное разведение. Если, например, необходимо изолировать бактерии из почвы, то используют последовательное разведение. Стерильную питательную среду (15 мл на чашку) разливают по чашкам, на затвердевший агар наносят по 0,1 мл последних трех разведений суспензии и стеклянным шпателем распределяют по поверхности.
Для выделения бактерий 1 г почвы суспендируют в 9 мл воды, хорошо взбалтывают, дают несколько секунд отстояться и из суспензии готовят последовательные разведения. С помощью этого метода можно определить число микроорганизмов в каждой пробе.