Стимуляция с помощью питательного субстрата. При использовании питательного субстрата в качестве стимулятора споруляции следует различать три возможности.
Во-первых, некоторые возбудители болезней реагируют образованием спор на бедный питательными веществами субстрат («голодные» питательные среды). Количество спор при этом, как правило, незначительное, но его достаточно для идентификации. Например, при переводе Sclerotinia sclerotiorum на водный агар (1000 мл дистиллированной воды, 20 г агара) этот гриб образует одноклеточные бесцветные конидии.
Вторая возможность — использование растительных субстратов (кусочки стеблей или соломы); их автоклавируют в закрытых культуральных сосудах (чашки Петри, пробирки, колбы Эрленмейера на 50 или 100 мл) и затем инфицируют. В процессе стерилизации некоторые органические вещества субстрата разрушаются или преобразуются, но он остается «подобным растению», что в некоторых случаях стимулирует спорообразование. Неавтоклавированный растительный субстрат значительно активнее способствует спорообразованию, но недостатком такой среды является сильное загрязнение, что осложняет идентификацию исследуемого возбудителя и уменьшает продолжительность использования культуры. Этот метод используется в специальных случаях, например при выявлении Phytophthora infestans путем перевода на клубни картофеля.
Третья возможность состоит в применении специальных питательных сред. Вызвать с их помощью спорообразование у грибов, не спорулирующих на стандартных питательных средах, удается гораздо реже. Примером служит использование пептонсодержащих питательных субстратов (солодо-пептонный или глюкозо-пептонный агар) для определения некоторых видов Drechslera (Helminthosporium), поражающих злаки. Чаще всего специальные среды используют для стимуляции массового образования спор уже после начала споруляции. К этому методу прибегают в тех случаях, когда необходимо иметь споровый материал в огромных количествах, например для проведения искусственного заражения при установлении патогенности. В качестве примера можно привести перевод Fusarium culmorum на агар Докса для массового получения конидий или на минеральные питательные среды с добавлением лактозы для образования хламидоспор.
Одним из немногих примеров образования фитопатогенными грибами половых форм плодоношения является культура представителей рода Pythium на «голодных» питательных средах.
Стимуляция образования органов полового размножения у представителей рода Pythium. Для идентификации видов Pythium мицелий, изолированный из больных частей растения, переносят в чашки Петри с агаризованным кукурузным экстрактом и выдерживают в темноте при 20—22°С. Через 4—7 дней на субстрате, служащем «голодной» питательной средой, образуются ооголии и антеридии, морфологические признаки которых, а также взаимодействие друг с другом можно использовать в качестве критерия идентификации. При дальнейшем культивировании (до девяти дней после посева) образуются также ооспоры, которые существенно облегчают точное определение патогена. Микроскопический контроль образующихся органов провести очень просто: тонкий кусочек агара размером 2 мм2 из чашки Петри переносят на предметное стекло, добавляют каплю ледяной уксусной кислоты с хлопковой синью и накрывают покровным стеклом. Препарат осторожно проносят над пламенем бунзеновской горелки для расплавления агара, затем его можно просмотреть под микроскопом.
Получение аскоспор возбудителя прикорневой гнили зерновых (Gaeumannomyces graminis) по Кноту. Корни растений пшеницы в фазе 9—10,5 по Фикесу (незадолго до выколашивания) тщательно промывают выводе, разрезают на кусочки длиной 4 см и мокрыми закладывают в колбы Эрленмейера емкостью 300 мл, наполняя их примерно на две трети. После 20-минутной стерилизации при 0,15 МПа и посева колбы выдерживают 4—6 недель при 18—20 °С и дневном освещении. За это время образуется обильный мицелий и перитеции. Для получения аскоспор в колбы доливают стерильную воду, через 2 ч хорошо взбалтывают, сливают споровую суспензию и используют ее по назначению.
Стимуляция светом. По требованиям к свету для индукции споруляции in vitro фитопатогенные грибы делятся на различные группы, в пределах систематических единиц они ведут себя в этом отношении также по-разному.
Даже внутри отдельных видов у различных изолятов наблюдается разная потребность в свете для споруляции. Самая большая группа — это грибы, споруляция которых не зависит от освещения. Следующая группа слабо спорулирует в темноте и активно — при чередовании свет — темнота. Третья группа спорулирует при продолжительном освещении или при чередовании свет — темнота, но без света споруляция отсутствует вообще. Наконец, у представителей совсем немногочисленной группы споруляция особенно обильна при постоянном освещении.
Необходимая длина волн лежит в области длинноволнового УФ-света (от 300 до 420 нм), в качестве активного компонента эти волны действуют и днем. Поэтому, разместив культуру гриба таким образом, чтобы дневной свет попадал на нее беспрепятственно, можно стимулировать образование спор. Однако при использовании дневного света вследствие сильной зависимости от погодных условий и степени загрязнения воздуха нельзя обеспечить пи точных условий опыта, ни достоверной репродуцирующей способности. Следовательно, этот способ нужно рассматривать только как один из возможных вариантов. Значительно лучшие результаты дает применение ламп соответствующих типов.
Для этого пригодно следующее устройство. Шесть осветительных трубок длиной 110 см укрепляют параллельно на плоскости размером 120X50 см и размещают на высоте 40 см над поверхностью с культурами гриба; помещение должно иметь постоянную температуру в пределах 10—15 °С. Под влиянием света, как правило, тормозится образование воздушного мицелия, поэтому после посева на питательную среду культуры рекомендуется поместить на 8—14 дней в темноту для образования обильного мицелия, а затем выставить на свет для образования спор. По данным Шлёссера, хорошие результаты дает чередование 9 ч освещения и 15 ч темноты или же постоянное освещение. В качестве сосудов для культур используют пробирки (скошенный агар) и чашки Петри, оставляя их под лампами закрытыми.
Продолжительность периода до начала споруляции у разных грибов различна. Так, Septoria nodorum образует множество пикнид с пикноспорами через 8—10 дней, a Pseudocercosporella herpotrichoides — через 12—14 дней.
Примечание. Спорообразование фитопатогенов можно также индуцировать на растениях. Для этого пораженные части растений нужно хорошо очистить, поместить во влажную камеру, закрыть ее и перенести под лампу; крышку камеры нельзя выстилать фильтровальной бумагой.
Ранняя диагностика возбудителя пятнистости и ломкости стеблей зерновых (Pseudocercosporella herpotrichoides) по Клевицу. Кусочки (1—2 см) молодых растений зерновой культуры в фазе 2—3 листьев с сомнительными симптомами основательно моют в проточной воде. Побуревшие участки вырезают дезинфицированным скальпелем и помещают в чашки Петри на водный агар. Для уменьшения загрязненности при заливе агара в каждую чашку добавляют каплю 25%-ной молочной кислоты. Чашки выдерживают 3—5 дней при 19—20 °С и постоянном освещении. В этих условиях Р. herpotrichoides на пятый день образует обильные конидии.
Метод массового получения пикноспор Septoria nodorum под действием света. Возбудитель септориоза пшеницы Septoria nodorum (половая стадия Leptosphaeria nodorum) при нормальной культуре в темноте (термостат) за редким исключением образует только мицелий. Воздействие УФ-лучами позволяет получить большое количество содержащих споры пикнид. Питательным субстратом служат зерна пшеницы, для культуры наиболее удобны банки емкостью 200 мл из огнеупорного стекла с горлышком диаметром 40 мм, которое после заражспия зерен закрывают ватной пробкой, а для защиты от высыхания — фольгой. Культуры выдерживают около двух педель при комнатой температуре, причем легкое встряхивание закрытого сосуда через 3—4 дня после посева способствует быстрому зарастанию субстрата. Затем сосуды помещают на 14 дней под УФ-лампы для образования зрелых пикнид, после первых семи дней сосуды целесообразно повернуть. По окончании периода инкубации обросшие мицелием зерна высыпают и хорошо обсушивают на воздухе в умеренно теплом помещении. Зерна можно упаковать в воздухопроницаемые мешочки и хранить до приготовления споровой суспензии.
Стимуляция температурой. В целом спорулирующие in vitro грибы имеют широкий диапазон температур, в котором происходит образование спор. Поэтому за редким исключением при 18—20 °С можно получать достаточное для идентификации количество спор. Очень слабую споруляцию удается усилить, инкубируя культуры в условиях температурного оптимума (для некоторых грибов нужны более низкие температуры, например для Pseudocercosporella herpotrichoides — 3—4°С) в сочетании с оптимальными освещением и влажностью воздуха. У ряда видов, дающих in vitro только мицелий, спорообразование можно индуцировать длительным воздействием пониженных температур, постепенно добиваясь массовой продукции спор.
Методы массового получения пикноспор Septoria nodorum под воздействием температуры. Выше уже говорилось, что возбудитель септориоза пшеницы Septoria (Leptosphaeria) nodorum в темновой культуре (термостат) образует, как правило, только мицелий. Массовое бесполое спороношение S. nodorum может происходить не только под действием УФ-лучей, но и при длительном влиянии пониженных температур. По методу Бокманна, гриб сначала культивируют на зернах пшеницы, а после заселения субстрата помещают в холодильную камеру при 5°С в темноту или при слабом освещении. Через два-три месяца обильно образуются пикниды со спорами.
Примечание. После выноса из холодильной камеры материал нужно быстро использовать. Длительное хранение при температуре выше 20°С ведет к разрушению зараженных зерен, и культура становится мажущейся.
Стимуляция высокой влажностью воздуха. Как содержание пораженных частей растений во влажной камере, так и повышение влажности воздуха может привести к усилению спорообразования у культур in vitro. Для видов Drechslera, поражающих злаки, пригоден следующий метод. В чашки Петри диаметром 90 мм наливают 10 мл солодо-пептонного агара, так чтобы он покрывал дно, и на поверхность наносят 3—5 инфицирующих точек. Затем чашки инкубируют при комнатной температуре, приблизительно через 10 дней поверхность агара полностью зарастает мицелием. В стерильном помещении чашку открывают, без крышки помещают в чашку Петри большего диаметра (120 мм) со стерильной водой, закрывают и оставляют при дневном свете (или под УФ-лампой). Можно также снять поверхностный мицелий вместе с тонким проросшим слоем питательной среды и поместить во влажную камеру соответствующего размера. Под влиянием недостатка питательных веществ, а также высокой относительной влажности воздуха некоторые грибы образуют конидии в количестве, достаточном для идентификации. Для массового получения спор с целью искусственных заражений этот метод непригоден.