Эритроциты человека, взвешенные в средах с высокой концентрацией глицерина, не подвергаются воздействию избыточного наружного осмотического давления, поскольку глицерин проникает в клетки до тех пор, пока внешняя и внутренняя концентрации его не сравняются.
Эритроциты, перенесенные в среды с такой же концентрацией электролитов, но без глицерина, быстро набухают и гемолизируются, потому что молекулы воды быстрее проникают через оболочку в клетку, чем покидают ее молекулы глицерина. Глицерин и воду можно «обменять» с помощью диализа, но этот процесс протекает крайне медленно, причем возникает опасность бактериальной инфекции. Тогда исследователи направили усилия на поиски различных методов удаления глицерина. Ни глюкоза, ни цитрат натрия не способны быстро проникнуть в эритроциты. Их можно использовать для повышения осмотического давления в окружающей эритроциты среде. Так, добавление 1,0 М глюкозы или 0,33 М цитрата натрия приблизительно в семь раз увеличивает наружное осмотическое давление в клетках, которые были предварительно взвешены в среде, содержащей 0,16 М соли и 2,0 М глицерин. В результате глицерин и вода покидают клетки и внутриклеточная концентрация солей повышается. Лавлок охарактеризовал этот процесс как «осмотическое сжатие». После установления осмотического равновесия содержание воды и глицерина в клетках уменьшается примерно до 1/7 исходной величины. Если после этого эритроциты перенести в физиологический раствор или в плазму, они будут быстро впитывать воду, пока не восстановится их первоначальный размер, а также нормальное содержание воды и солей. Эритроциты, обработанные таким способом, внешне не изменялись, и, судя по специальным пробам, их осмотическая резистентность оставалась в норме.
Браун и Хардин применили такой же принцип для удаления глицерина из замороженных эритроцитов. Они использовали концентрированный раствор лактата натрия для поддержания достаточно высокого осмотического давления в среде, окружающей оттаянные клетки. Тем самым предотвращался гемолиз в процессе отмывания растворами с постепенно понижающейся концентрацией глицерина. Всего лишь около 64% замороженных клеток, освобожденных таким путем от глицерина, не были повреждены после переливания. Объясняется это тем, что или находившийся внутри клеток глицерин не был полностью удален, или же эритроциты были повреждены в результате воздействия слишком высоких концентраций глицерина еще до замораживания.
Словитер изучал возможное токсическое действие остаточного глицерина в замороженной крови и нашел, что низкая концентрация глицерина в переливаемой крови не сокращает продолжительности жизни клеток и не вызывает никаких нежелательных явлений у реципиентов. Он обрабатывал уплотненные эритроциты равным объемом раствора, содержащего на 100 мл 40 г глицерина, 25 г цитрата натрия и 0,2 г лимонной кислоты. После хранения при температуре —20° в течение 1—210 дней эритроциты согревали при +40°. К оттаявшим эритроцитам добавляли в соотношении 1 : 2 раствор, содержащий на 100 мл 50 г глюкозы и 0,9 г хлористого натрия. Спустя 10 мин взвесь разбавляли двойным объемом 0,9-процентного раствора NaCl, так что концентрация глицерина понижалась примерно до 4,5%. Когда пробы эритроцитов, взвешенные в растворах, содержащих около 4,5% глицерина, вводили в большие объемы плазмы, 3,7—9,8% клеток гемолизировалось. При переливании других проб кроликам никаких вредных влияний, обусловленных остаточным глицерином или гемолизом, не отмечалось.
Эритроциты человека, хранившиеся в среде с примесью глицерина в течение 4 месяцев при —20° или в течение 18 месяцев при —79°, а затем обработанные концентрированной глюкозой с целью снижения содержания глицерина приблизительно до 5%, метили радиоактивным хромом (Cr51). После переливания клетки нормально функционировали в кровотоке реципиента.
Большинство терапевтов, хирургов и физиологов предпочитают перед переливанием согретых эритроцитов полностью удалять глицерин. В настоящее время его можно быстро и хорошо отмыть путем центрифугирования, начиная с концентрированного раствора какой-либо соли, которая, как предполагает Лавлок, не проникает в клетки. Первый прибор для центрифугирования был несложным по конструкции и состоял из конусообразного сосуда, насаженного на вращающийся диск и имеющего выходные отверстия вблизи горловины. Кровь, содержащую 30% глицерина, обрабатывали соответствующим количеством гипертонического раствора цитрата натрия и давали ей вытекать по капле в смесительную камеру, в которую добавляли равный объем 0,85-процентного раствора хлористого натрия. Из смесительной камеры кровь вытекала во вращающийся сосуд, эритроциты отбрасывались на стенки сосуда, а жидкость вытекала через верхние выходные отверстия. Отмывание 0,85-процентным раствором хлористого натрия продолжали до полного удаления глицерина и цитрата. Браун и Хардин приспособили для этой цели обычную насадку центрифуги, но получили не очень хорошие результаты ввиду неравномерного отмывания во всех четырех сосудах. Впоследствии была сконструирована специальная насадка, которую можно приспособить к обычной лабораторной центрифуге. На ней закреплены горловинами наружу 2 сосуда для крови емкостью по 550 мл каждый.
Сосуды заполняются независимо друг от друга из двух отдельных резервуаров. Отмывать начинают средой, содержащей глицерин в более низкой концентрации, а цитрат натрия в более высокой, чем среда, в которой были заморожены клетки. Концентрация глицерина и цитрата в отмывающей жидкости постепенно понижается. Из верхнего резервуара емкостью 2 л физиологический раствор поступает в меньший резервуар, в котором находится и 5-процентный раствор цитрата натрия, содержащий 16% (вес/объем) глицерина. Трубка, отходящая от этой системы, подведена к сосуду с кровью. В обычном опыте прохождение 1250 мл отмывающей жидкости в течение 2,5 час понижало концентрацию глицерина в клетках с 30 до 0,6%, причем 95% эритроцитов не повреждалось. Гемолиз можно было полностью предотвратить, изолируя насадку центрифуги от мотора или же используя рефрижераторную центрифугу. Для удаления глицерина из замороженных клеток приспособили также центрифугу Кона и получили прекрасные результаты.