Для выделения возбудителей болезней наиболее пригодны слабопораженные растения.
Кроме того, иногда приходится выделять патогены из почвы, поэтому ниже приводятся методики и этой работы.
Многочисленные методы выделения грибных возбудителей ив почвы можно разделить на две группы — методы промывки на ситах и методы приманок и ловчих растений. Все они имеют один недостаток, т. е. в первую очередь обеспечивают лишь качественное обнаружение какого-то возбудителя, а получение количественных результатов возможно лишь в ограниченном объеме.
При определении зараженности почвенных проб возбудителями болезней необходимо учитывать срок отбора проб (вегетационный период), глубину отбора (корнеобитаемый слой), вид и сорт возделываемой культуры. Подробная сводка и описание важнейших почвенных грибов приведены в работе Домша и Гамса.
Метод промывки на ситах. Метод основан на получении промывающего эффекта при турбулентном движении воды, добавленной к определенному объему почвы. В простейшем случае этого эффекта можно достигнуть путем встряхивания вручную почвенной пробы в закрытом сосуде с водой и пропускания полученной суспензии через сито. Имея соответствующее оборудование, можно промывать почвенную пробу струей воды при одновременном встряхивании. Промывную воду затем исследуют на наличие спор возбудителей, а остаток на сите — на наличие покоящихся структур грибов (склероции видов Sclerotinia, Typhula, Botrytis и др.). Частицы почвы на нижнем, самом мелком сите пригодны для выделения мицелия. Исследование промывной воды проводят разными путями: под микроскопом, применяя Коховский метод разлива в чашки или готовя ряд последовательных разведений с дальнейшей идентификацией развившихся на питательной среде культур.
Для выделения мицелия частицы почвы раскладывают на поверхность питательной среды в чашках Петри. При этом рекомендуется использовать селективные среды, соответствующие требованиям исследуемого гриба, и добавлять вещества, тормозящие рост бактерий, например хлорамфеникол, тетрациклин, пенициллин, нистатин и др. Чтобы по возможности уменьшить загрязнение бактериями, Гаме и Домш рекомендуют промыть частицы почвы водой с ауреомицином (50 мл/л), высушить на стерильной фильтровальной бумаге и лишь затем поместить на агар. Для быстрорастущих грибов, в частности для представителей рода Rhizoctonia, пригодны мало или совсем не содержащие питательных веществ субстраты (2%-ный водный агар с добавлением антибиотиков). Следует иметь в вицу, что некоторые почвообитающие грибы, например Gaeumannomyces graminis, можно выделить почти исключительно из органических частиц.
Для выделения многих почвообитающих возбудителей болезней, например видов Pythium, в посевах свеклы разработаны специальные методы.
Обнаружение видов Pythium в почве по Бёттхеру и Бэру. На посевах свеклы с глубины 3—5 см отбирают пробы почвы. Комочки массой 0,02—0,04 г раскладывают в чашки Петри, вдавливая в незастывшую среду из 2%-ного агара с добавлением по 50 мг/л нистатина, пенициллина и стрептомицин-сульфата. После застывания среды покрытые агаром комочки почвы переносят в агар на кукурузном отваре и инкубируют 48 ч при 22—24 °С; виды Pythium можно идентифицировать по картине роста на среде.
Метод флотации. Метод флотации как модификация метода промывки основан на использовании различных градиентов плотности для отделения сравнительно крупных спор от частиц почвы. Почву с добавлением парафинового масла или другого флотатора, к которому иногда примешивают хлопковую синь в качестве красителя, суспендируют в воде. Всплывающий флотатор со спорами очищают от загрязнений путем центрифугирования и исследуют под микроскопом.
Метод приманок. Части растений (естественная приманка) или какой-либо питательный субстрат (искусственная приманка) помещают на некоторое время в почву. После заселения почвенными грибами приманки служат исходным материалом для изоляции. Этот метод имеет определенные недостатки: во-первых, кроме патогенных, выделяются и непатогенные грибы; во-вторых, приманки заселяются в основном родами и видами с высокой сапрофитической конкурентной способностью (Rhizoctonia, Fusarium). Для обнаружения медленно растущих или узкоспециализированных возбудителей, например Pseudocercosporella herpotrichoides, Plasmodiophora brassicae и Synchytrium endobioticum, метод приманок непригоден. Этих возбудителей удается обнаружить только при возделывании ловчих растений.
В качестве естественных приманок пригодны стебли гречихи — для Rhizoctonia solani, кусочки картофеля и огурца — для видов Pythium, незрелые яблоки — для Phytophthora cactorum. Искусственной приманкой могут служить перфорированные стеклянные пробирки, заполненные питательной средой, или пластинки размером 20X30 см с 60—70 лунками диаметром 0,5 и глубиной 1 см, заполненными агаром и покрытыми перфорированной клейкой пленкой. Для этого же пригодны диски фильтровальной бумаги или куски поролона, пропитанные питательным раствором it помещенные в перфорированную оболочку. Возбудителей выделяют на питательный субстрат в пробирках или чашках Петри.
Обнаружение возбудителя корневой гнили (Phytophthora cactorum) в почве. Незрелые яблоки тщательно моют, накалывают обожженной в спирте иглой и на 3/4 закапывают в исследуемую почву. Через шесть дней яблоки вынимают и выделяют возбудителя из бурых загнивших тканей.
Метод ловчих растений. Узкоспециализированные формы патогенов можно обнаружить путем возделывания ловчих растений. Иногда при этом удается определить отдельных возбудителей, в частности спороносящих на ловчем растении. Во всяком случае, таким способом выделить возбудителя растения проще, чем из почвы. Недостатками по сравнению с другими методами являются, как правило, значительно большая затрата времени, обусловленная длительностью периода от высева семян или высадки растений до появления симптомов, а также зависимость поражения от окружающих условий, особенна от погоды и восприимчивости ловчих растений. Наиболее известный пример ловчего растения — белая горчица (Sinapis alba) для обнаружения в почве Plasmodiophora brassicae.