При механическом переносе вирусы выделяют из зараженных растительных тканей и через искусственные поранения вводят в листья тест-растений, на которых появляются определенные реакции.
Наиболее распространенная техника инокуляции — натирание поверхности листа.
Инокуляция стеклянным шпателем. Отбор материала для инокуляции. Как правило, материалом, из которого экстрагируют вирус для инокуляции, служат молодые листья, так как в сравнении со старыми они содержат меньше ингибиторов инфекции. У видов растений, богатых ингибиторами вирусов, например у розоцветных, для механического переноса пригодны только самые молодые листья. Для определения вирусов семечковых плодовых, например вируса хлоротической пятнистости яблони, в качестве материала для инокуляции наиболее пригодны лепестки цветков.
Некоторые вирусы, встречающиеся на плодовых деревьях, можно выделить из зрелых плодов. Механический перенос других, особенно почвообитающих вирусов (вирус некроза табака), лучше всего удается при использовании мочковатых корней. Среди вирусов, поражающих сахарную свеклу, вирус мозаики изолируют не только из листьев, но и из ткани корня.
Отбор материала для инокуляции необходимо проводить тщательно дезинфицированными инструментами. При работе загрязненными руками или недезинфицированными инструментами в инокулюм могут попасть стойкие вирусы, например вирус табачной мозаики, что приведет к ошибочному диагнозу. Поэтому перед отбором материала руки следует вымыть дезинфицирующим средством (эпизан) и после этого уже не прикасаться к недезинфицированным предметам. Пинцет для отбора пробы листьев предварительно погружают в спирт; ступку, пестик, а также инструменты для механического переноса (стеклянный шпатель) тщательно моют, погружают в дезинфицирующий раствор и выдерживают в сушильном шкафу 2 ч при 120 °С.
После отбора пробы помещают в чистые этикетированные пленочные пакеты или сразу растирают в ступке. Для длительного хранения пробы необходимо охладить при 4—10 °С.
Приготовление инокулюма. При получении инокулюма следует учитывать различную пригодность материалов для экстракции вирусов. Листья тыквенных, злаковых, пасленовых культур более пригодны для этой цели, чем листья гвоздичных, маревых, гераниевых или розоцветных, растения которых содержат ингибиторы. Экстракты из листьев или органов с низкой концентрацией ингибиторов (лепестки, самые молодые листья) готовят в большинстве случаев с добавлением 0,03 М фосфатного буфера (pH 7,5). Для его получения смешивают 852 мл раствора Na2HPO4 (6,9 г/л) и 148 мл раствора КН2РO4 (4,5 г/л), с помощью pH-метра проверяя реакцию смеси. Соотношение растворов при смешивании можно изменить в соответствии с нужным значением pH: для pH 7,0—612 : 388 мл, для pH 6,6 — 313 : 687 мл. В экстракты из листьев или органов, содержащих большое количество ингибиторов (корни, нижние листья), добавляют стабилизирующие вирус вещества.
Снижение инфекционности может быть вызвано высокой кислотностью соков, как у гераниевых и розоцветных. В этом случае щелочного фосфатного буфера недостаточно, приходится применять более сильные щелочные соединения. Наилучшими оказались при этом 2%-ные растворы никотин-основания и никотин-сульфата. Аналогичным действием обладает и кофеин. Инфекционность снижают также таннины и полифенолы, часто присутствующие в растительном соке и осаждающие белки. При высокой концентрации вируса в экстракте их действие можно ослабить простым разбавлением (например, 1 часть растительной ткани на 10 частей фосфатного буфера) или же повышением значения pH до 8, поскольку при этом связывание вирусов таннинами ослабевает, а экстрагируемость белков возрастает.
Адсорбцию ингибиторов или вирусинактивирующих ферментов обеспечивают дозированные добавки порошка алюминия, активировапного угля или бентонита. Однако они адсорбируют и вирусные частицы, поэтому при низких концентрациях вируса их использование не дает преимуществ.
В результате ферментативного окисления в растительных экстрактах могут образовываться о-хиноны и другие продукты окисления с ингибирующим действием. Их нейтрализуют добавками редуцирующих веществ, например сульфита натрия, цистеина солянокислого, аскорбиновой кислоты, а также хелатобразующих соединений, в частности диэтилдитиокарбамата натрия (ДИЭКА-Na). Стабилизирующее действие, особенно на вирусы с удлиненными частицами, оказывают ионы магния, в то время как ионы фосфатов ускоряют деградацию вирусных частиц. Поэтому часто применяют также боратный или трис-буфер с добавкой MgSO4.
Поскольку растительные соки оказывают разностороннее влияние на содержащиеся в них вирусы, при экстракции последних из богатых ингибиторами тканей для механической инокуляции травянистых растений-индикаторов рекомендуется применение следующих добавок:
0,2 М боратный буфер, pH 9;
2% никотин-основания или никотин-сульфата;
0,05 М трис-соляный буфер (pH 8) + 0,01 М MgSO4,
0,01 М трис-соляный буфер (pH 7,5) + 0,005 М MgSO4 + 0,l% Na2SO3 + 0,l% аскорбиновой кислоты + 1% никотина;
0,03 М фосфатный буфер (pH 8) + 0,02 М ДИЭКА-Na;
0,015 М, N, N’-дифенилдитиомочевина + 0,03 М кофеин в 0,03 М фосфатном буфере (pH 8,5).
Соотношение (растительные ткани : добавки) должно соответствовать виду или органу растения, из которого экстрагируется вирус. Для тканей, бедных ингибиторами и богатых влагой (лепестки цветков, листья огурца), это соотношение может составлять 1:3, для тканей, содержащих ингибиторы и большое количество сухого вещества (листья черешни или пеларгонии), необходимо соотношение от 1 : 5 до 1 : 10.
Растительную ткань растирают в ступке до получения однородной суспензии, постепенно вводя буферный раствор со стабилизаторами. Измельчение тканей ускоряется и улучшается при добавлении стерильного прокаленного кварцевого песка.
Подбор и выращивание тест-растений. Поскольку для характеристики вирусов большое значение имеет круг их растений-хозяев, выбор подходящих тест-растений для механической инокуляции играет при диагностике решающую роль. Среди многочисленных видов, известных как хозяева определенных вирусов, некоторые особенно чувствительны, поэтому их применяют в биотестах. Это Chenopodium quinoa, Cucumis sativus, Gomphrena globosa, Nicotiana megalosiphon, N. tabacum, Petunia hybrida, Phaseolus vulgaris.
Важнейшим и восприимчивым к большинству вирусов тест-растением является Chenopodium quinoa. Этот вид особенно пригоден для выделения вирусов и в меньшей степени — для их дифференциации и идентификации. В последнем случае приходится делать пассажи с одного растения Ch. quinoa на другое (чтобы повысить концентрацию вируса), а также переносить его на дифференцирующего хозяина или применять серологическую диагностику. При необходимости в частых определениях зараженности вирусами или при подозрении на смешанную инфекцию целесообразно поддерживать в готовом к работе состоянии сортимент различных вирофильных растений-индикаторов и использовать их для изолирования вирусов.
Тест-растения выращивают следующим образом. Семена раскладывают на влажную фильтровальную бумагу в чашках Петри и проращивают при 25 °С. Всходы пикируют в рассадные ящики с пропаренной или автоклавированной смесью земли, песка и торфа (1:1:1). После образования первых настоящих листьев растения пересаживают в горшки диаметром около 7 см. Горшки перед употреблением тщательно моют мыльной водой (1 часть мыла на 20 частей воды) и ополаскивают, почвенную смесь пропаривают 2 ч при 100 °С и после этого выдерживают не менее недели. Поскольку чувствительность тест-растений к вирусным инфекциям может изменяться под влиянием факторов среды, их нужно выращивать в благоприятных условиях. Растения, выросшие при избытке света, пониженных температурах и недостатке влаги, мало пригодны для диагностики. Затемнение на 24—72 ч перед инокуляцией повышает вероятность заражения. После инокуляции более благоприятны высокая интенсивность света и температуры ниже 25 °С, дальнейшее их повышение (>30°С) ставит под сомнение успех опыта.
Инокуляция. При механическом переносе инокуляция проводится путем растирания тканевого экстракта но верхней стороне листа тест-растения. Через возникающие при этом мельчайшие ранки вирусные частицы проникают в еще живые клетки и инфицируют их. Количество очагов инфекции можно существенно увеличить с помощью мелкозернистых абразивов, например карборунда (размер частиц от 500 до 600 меш). Абразив напыляют на поверхность листа перед натиранием или добавляют в инокулюм. Искусственные ранки должны быть очень мелкими, чтобы они быстро заживали и не вызывали гибели клеток, поэтому натирание следует проводить очень осторожно и только с легким нажимом.
Для инокуляции применяют дезинфицированный стеклянный шпатель с шероховатой поверхностью. Иногда листья натирают пальцем, однако при этом возрастает опасность загрязнения следующих образцов, особенно при работе с высококонцентрированными и стойкими вирусами. Стеклянный шпатель после каждого употребления очищают и дезинфицируют.
Натирание выполняется круговыми движениями смоченного в экстракте стеклянного шпателя по поверхности листа, который поддерживают свободной рукой. После натирания инокулированную поверхность листа обмывают водопроводной водой, чтобы ослабить ингибирующее инфекцию действие инокулюма. Быстрое обсушивание поверхности листа повышает успех заражения.
Реакция тест-растений. Постинфекционные реакции тест-растений, в зависимости от комбинации вирус — хозяин, появляются через несколько дней или недель. Это могут быть симптомы на инокулированных листьях или на листьях, развившихся после заражения. ВТМ вызывает через 2—3 дня местные некрозы на N. glutinosa. Примерно через 5—7 дней после инокуляции Х-вирусом картофеля (ХВК) на листьях G. globosa появляются светло-серые пятна с красноватой каймой. На Ch. quinoa вирус огуречной мозаики вызывает через 5—7 дней желтоватые или буроватые местные некрозы, а вирус скручивания листьев вишни через две недели — деформацию и некрозы верхушечных листьев. При заражении вирусом пестростебельности табака на верхних листьях N. tabacum через 2—3 недели появляются светло-зеленые и некротические полосы и кольца.
Для биологической диагностики вирусов необходимо не менее шести растений каждого вида индикатора, а при использовании проростков огурца в качестве тест-растений — не менее 20 на каждую пробу.
Дифференциальная диагностика на индикаторах. При естественном развитии вирусных болезней чаще всего встречаются смешанные инфекции. Механическое заражение тест-растений вирусами в большинстве случаев не дает ответа на вопрос о компонентах такой инфекции. Поэтому дифференцирующие растения для разделения смесей вирусов и штаммов исключительно важны с точки зрения диагностики. Возможности разделения некоторых часто встречающихся смесей и идентификации вирусов и их штаммов на дифференцирующих растениях можно показать на ряде примеров.
На табаке, томате и других культурных растениях ветре даются различные штаммы ВТМ. Дифференциация вируса табачной мозаики (ВТМ) и вируса мозаики томата (ВМТо) возможна с помощью тест-растений.
Вирусы М и S картофеля (МВК и SBK) часто встречаются в смешанных инфекциях, и их точная дифференциация по симптомам часто не удается. При механическом переносе смеси на Ch. murale SBK можно отделить от МВК, поскольку первый заражает листья этого индикатора системно, а второй не заражает.
Различные розоцветные, в том числе плодовые культуры, а также другие виды культурных растений поражаются смесями непо — и иларвирусов. Для их разделения используют растения-дифференциаторы.