Относительно механизма биосинтеза стрептомицина имеются крайне ограниченные и подчас противоречивые данные.
Пока еще не известны предшественники. Основные опыты по изучению биосинтеза стрептомицина, проводимые с «мечеными» соединениями, были поставлены с целью выяснения путей образования гуанидиновых групп и аминосахара. Опыты с применением меченных по углероду (С14) глюкозы, крахмала или его гидролизата показали, что наиболее интенсивно включается в состав молекулы стрептомицина глюкоза. При этом «метка» распределяется довольно равномерно между стрептозой, стрептамином и N-метил-L-глюкозамином. Радиоактивность гуанидиновых групп оказывается значительно ниже, что, по-видимому, свидетельствует об их образовании из иного источника углерода.
Стрептидиновая часть молекулы стрептомицина богата азотом, отношение N:C = 0,9; во всей молекуле стрептомицина это отношение — 0,38. Для большинства белков, входящих в среды, отношение N : С = 0,31. Азот стрептидиновой части представлен гуанидиновыми группами. В связи с этим возникло предположение, что увеличить продуктивность культуры можно путем введения в среду компонентов, содержащих гуанидиновые группы при отношении N: С выше, чем в белках. Такими веществами были избраны аргинин (N:C = 0,78), гуанидин (3,0), мочевина (2,0).
Поскольку основу структуры стрептидина составляет инозит, параллельно с веществами, содержащими гуанидиновую группировку, в среды вводили инозит. Все опыты ставились на синтетической среде. Результаты опытов показали, что комбинация аргинина и инозита положительно влияет на биосинтез стрептомицина, на его накопление в культуральной жидкости.
Horner (1964) положительная роль миоинозита была показана в опытах с мечеными соединениями. Наибольшее количество радиоактивного углерода было обнаружено в стрептидиновой части молекулы. По мнению Hunter и Hockenhull (1955), основу углеродного скелета стрептидиновой части молекулы может создать какое-либо производное глюкозы, например глюкозамин-6-фосфат.
Из природных продуктов богата аргинином соевая мука (до 15,7% аргинина по азоту). Изучение влияния кислотных гидролизатов богатой аргинином соевой муки и бедного аргинином казеина на содержание стрептомицина в культуральной жидкости показало, что гидролизат белков сои способствует образованию стрептомицина лучше, чем гидролизат казеина при тех же условиях. Если к синтетической среде добавить в качестве единственного источника азота гидролизат белка, в котором удалены основные аминокислоты (аргинин, лизин, гистидин), то стимулирующий эффект при этом резко снижается (до 50%), хотя развитие актиномицета идет вполне нормально. Не исключена возможность, что одним из положительных моментов, определяющих широкое применение соевой муки в промышленности для биосинтеза стрептомицина, является высокий процент аргинина в ней (П. А. Агатов и Т. Б. Казанская, 1958; Н. С. Егоров и Т. П. Удалова, 1962).
При введении меченого С14 аргинина в среду для культивирования продуцента стрептомицина было установлено, что по существу все С14 были локализованы в гуанидиновых группировках молекулы антибиотика. Очевидно, функция аргинина как промежуточного вещества при биосинтезе стрептомицина заключается в переносе гуанидиновых групп, т. е. происходит так называемая реакция переамидинирования. Наличие этого фермента обнаружено у многих продуцентов стрептомицина, причем отмечается повышение энзиматической активности параллельно с нарастанием содержания антибиотика в культуре. Сущность реакции заключается в переносе амидиновой группы от молекулы гуанинсодержащего вещества, являющегося донатором, к акцептору. Акцепторами обычно выступают соединения, обладающие аминогруппой.
Одним из веществ, имеющих гуанидиновую группировку при R1, является аргинин. Для некоторых штаммов продуцентов стрептомицина показано, что наилучшим акцептором является глицил-глицин.
Относительно механизма переноса амидиновой группы существуют две точки зрения. Согласно одной из них, происходит двуступенчатая реакция. На первой ступени образуется в качестве промежуточного продукта фермент-амидиновый комплекс, на второй — перенос амидиновой группы из комплекса на молекулу фермента. По мнению других исследователей, реакция происходит в одну ступень путем прямого взаимодействия донатора и акцептора на поверхности фермента без образования промежуточного комплекса. Активность трансамидазы продуцента стрептомицина заметно подавляется ионам двухвалентной меди (1 · 10-4 М).
Другой группировкой молекулы, механизм включения которой изучался, является N-метил-L-глюкозамин. На синтетической среде, в которую вводили «меченый» N-метил-L-(С14)-глюкозамин, культивировали продуцент стрептомицина. После выделения и очистки антибиотика в основных структурных элементах стрептомицина определяли радиоактивность. Результаты опытов показывают, что наивысшей радиоактивностью обладает N-метил-L-глюкозаминная часть молекулы. Предполагают, что N-метил-L-глюкозамин целиком включается в молекулу антибиотика. Первым этапом является аминирование глюкозы с образованием глюкозамина, а затем его метилирование.
Включение азота при образовании глюкозамина, вероятно, происходит на уровне глюкозо-6-фосфата. Донатором метильной группы является метионин. Стимулируют реакцию метилирования витамина B12 и парааминобензойная кислота.
Как показали исследования В. А. Севериной, С. В. Горской и И. В. Грачевой (1959), биосинтез стрептомицина значительно усиливается при введении в среду для культивирования амидов дикарбоновых аминокислот: глютамина и аспарагина. Одновременно в культурах увеличивается содержание глюкозамина. Было высказано предположение, что амиды являются донаторами аминогруппы глюкозамина. Однако прямые доказательства этого факта не получены. В опытах, которые были проведены группой сотрудников под руководством А. С. Хохлова (1964) и где были использованы соединения, «меченные» стабильным изотопом N15, не удалось подтвердить этой теории. Возможно, что эта теория применительно к другим объектам является справедливой.
Одним из важных теоретических вопросов биогенеза L-глюкозамина является биохимический механизм превращения D-глюкозы в L-форму. Опыты, поставленные с применением меченых соединений, показали, что превращение возможно путем эпимеризации всех асимметричных атомов углерода глюкозы.
Второй структурной единицей стрептобиозаминовой части молекулы стрептомицина является стрептоза, обладающая несвойственной природным углеводам L-конфигурацией.
Кроме того, она представляет собой углевод с разветвленной углеродной цепочкой, что значительно осложняет изучение путей ее биогенеза. Известно, что стрептоза, по-видимому, образуется из D-глюкозы. М. М. Шемякиным, А. С. Хохловым и М. Н. Колосовым (1952) высказана гипотеза о вероятном механизме превращения углеводов с прямой в углеводы с разветвленной цепью. Согласно этой гипотезе, гексозы с прямой цепью могут переходить в дикарбонильные соединения с разветвленной цепью путем последовательных превращений сначала в кетоальдегиды, а затем циклические ацилоины.
Стрептамин, содержащий С14, при введении его в среду не включался столь эффективно в стрептомицин, как N-метил-L-глюкозамин. Содержание радиоактивных изотопов в стрептидиновой части молекулы, где можно было ожидать их высокий уровень, оказалось низким. По-видимому, образующийся при щелочном гидролизе стрептидина стрептамин не является метаболитом, промежуточным продуктом биосинтеза стрептомицина.
Взаимосвязь между биосинтезом антибиотика и отдельными метаболитами, которые могут иметь значение для его образования, может быть в известной степени установлена применением ингибиторов энзиматических реакций. Применение атебрина (2·10-4 М и 4·10-4 М) и 2-4-динитрофенола (2·10-4 М) оказало угнетающее действие на биосинтез стрептомицина и почти не влияло на урожай. Атебрин является веществом, которое угнетает процесс окислительного фосфорилирования. Введение в состав среды дополнительно к атебрину или 2-4-динитрофенолу диэтилбарбитуровой кислоты снимало их угнетающее действие. Барбитураты, очевидно, включаются в некоторые процессы переноса электронов и фосфорилирования. Детальный механизм их действия не изучен, однако очевидно, что биосинтез антибиотика зависит от нормальных окислительно-восстановительных процессов и фосфорилирования.
Ферментация срептомицина. Биосинтез стрептомицина проводят на комплексных средах, содержащих соевую муку, глюкозу, сернокислый аммоний, поваренную соль, мел, фосфаты. Иногда в среду в дополнение к указанным веществам вводят кукурузный экстракт, в концентрациях меньше соевой муки в 10—15 раз. Вместо соевой муки оказывается пригодной арахисовая мука или ее гидролизат, жмыховый экстракт или его гидролизат; глюкозу возможно заменить крахмалом. Для некоторых штаммов глюкоза может быть заменена полностью гидролом. Однако не для всех штаммов гидрол является подходящим. Среди углеводов, присутствующих в гидроле, имеется дисахарид, генциобиоза, которая используется не всеми штаммами одинаково хорошо. Поэтому в случае наличия в среде генциобиозы рост культур может замедляться.
Вместо комплексной среды предложена синтетическая среда, содержащая глюкозу, молочную кислоту, сульфат аммония, однозамещенный фосфат калия, сульфаты магния, железа, марганца и цинка. Синтетическая среда позволяет получать до 2000 EД/мл стрептомицина в культуральной жидкости.
Существенное значение для биосинтеза стрептомицина имеет концентрация в среде фосфора. Как и при биосинтезе других антибиотиков, отрицательное влияние оказывает его избыточное содержание. В состав сред обычно входит хлористый натрий. В присутствии хлористого натрия увеличивается проницаемость клеточной оболочки и при этом происходит более легкий переход стрептомицина в окружающую среду.
Процесс биосинтеза стрептомицина является двухфазным. Ферментация продолжается около 96 ч. За ходом ферментации осуществляется контроль, аналогичный описанному в производстве пенициллина.
Контрольные показатели в зависимости от состава среды, штамма и технологических особенностей процесса обычно приводятся в регламентах. Существенным звеном в контроле производства стрептомицина, равно как и других антибиотиков, продуцируемых актиномицетами, является отсутствие фага. Наиболее перспективным является получение фагоустойчивых культур методами селекции.