Учитывая малую проникающую способность УФ-лучей, нами совместно с сотрудниками отдела свободных радикалов Института физической химии АН УССР была разработана методика облучения в резонаторе прибора ЭПР грибных конидий или меланинового пигмента: навеску (1 мг) наносили тонким равномерным слоем на клейкую основу на покровном стекле или фторопластовой болванке (Жданова и др., 1978). Всю систему помещали в кварцевую ампулу, пропускающую УФ-лучи. Оказалось, что изменение сигнала ЭПР меланинового пигмента под влиянием УФ-облучения можно наблюдать только при низких температурах. Охлаждение образцов производили струей газообразного азота. Заданный температурный режим в резонаторе прибора поддерживали с точностью ± 0,5°.
Изменение интенсивности сигнала ЭПР меланинового пигмента рассчитывали в относительных единицах I пигмента / I стандарта в процентах по отношению к I пигмента / I стандарта, неподвергавшегося действию УФ-лучей. Это давало возможность сравнивать данные повторных измерений и результаты, полученные на разных объектах.
Источником УФ-излучения служила лампа ДРШ-1000, заключенная в металлический кожух с водным охлаждением. Пучок света системой кварцевых линз фокусировали на образец в резонаторе прибора. Перед линзами помещали кварцевую кювету, наполненную дистиллированной водой (водный фильтр) для поглощения теплового излучения, и фильтр УФС-1, пропускающий УФ-лучи в диапазоне от 240 до 400 нм. Работа проводилась на Cladosporium transchelii, трех его пигментированных мутантах Ч-1, К-1 и БМ, меланине, выделенном из С. transchelii, а также видах Oidiodendron cerealis и Stemphylium ilicis. Облучение грибных конидий УФ-лучами вызывало заметные, регистрируемые методом ЭПР, изменения парамагнитных свойств пигментов.
Изучение влияния УФ-облучения на меланиновый пигмент С. transchelii 396 проводили при температурах —120°, —80°, —40° и 0° С. При —120° интенсивность сигнала увеличивалась на 30%, при —80° на 18—20%, при 0° интенсивность сигнала не отличалась от контроля, т. е. понижение температуры способствовало более четкому проявлению эффекта облучения.
На кривых, отражающих кинетику процесса, наблюдалось увеличение интенсивности сигнала, после чего она не изменялась на протяжении довольно длительного времени облучения (до 60 мин). При температуре —40° сигнал ЭПР достигал максимума после 5-минутного облучения, при —80° — после 7 — и при —120° — 7—9-минутного. С прекращением облучения величина сигнала при температуре —120° в течение 40—50 мин наблюдения практически не изменялась. При температуре —80° небольшое уменьшение сигнала (на 10%) регистрировали уже через 7—10 мин, тогда как через 5 мин после прекращения облучения интенсивность сигнала снижалась почти до контрольной величины.
Следует отметить, что описанные эффекты наблюдались и при облучении изолированного меланинового пигмента. Максимальный световой сигнал при температуре —120° превышал контрольный на 50%, при —80°— на 45% и при 40° — на 8—10%. Процесс переходил в стадию насыщения при —120° через 9—11 мин, при —80° С через 7—9 мин и при —40° С через 3—6 мин. Прекращение облучения не приводило к существенному изменению сигнала ЭПР при —120°: в первые 5 мин он уменьшался только на 5—7% и затем оставался без изменений на протяжении 50 мин наблюдения. При температуре —80° С наблюдалось медленное уменьшение интенсивности сигнала (на 10%) на протяжении 45 мин, а при —40° С сигнал практически не изменялся.
Меланиновый пигмент устойчивого к УФ-лучам мутанта Ч-1 меньше реагировал на УФ-облучение, чем таковой исходной культуры С. transchelii. При температуре —120° максимальное увеличение сигнала ЭПР меланина мутанта превышало контрольное значение на 18—20%, а при —80° и —40° — только на 6—8%. Стабильный максимум интенсивности сигнала ЭПР, подобно описанному ранее у С. transchelii, при —120° регистрировали через 7—9 мин, а при —80° и —40° — через 5—7 мин. С прекращением облучения во всех вариантах опыта интенсивность сигнала практически не изменялась в течение 40 мин.
Облучение мутанта К-1 при температурах —120°, —80° и —40° сопровождалось увеличением интенсивности сигнала ЭПР, достигающего максимального значения только через 40—45 мин, а при 0° С — через 20 мин и при дальнейшем облучении не изменялось. При температуре —120° С значение сигнала ЭПР превышало контроль в 5,5 раза, при —80° С в 4 раза — при —40° в 3,8 раза, и в 1,8 раза при нулевой температуре. Кроме того, после прекращения облучения заметно снижалась стабильность светового сигнала ЭПР. При —120° интенсивность сигнала ЭПР в течение первых 15—17 мин наблюдения уменьшалась почти на 25%, а при —80° и —40° — на 40%.
Аналогичным образом изменялась интенсивность сигнала ЭПР меланина грибов Stemphylium ilicis и Oidiodendron cerealis.
Таким образом, в процессе облучения перечисленных видов и мутантов грибов характер кинетики сигнала ЭПР меланина в основном оставался одинаковым, но количественные отличия зависели от вида гриба, содержания меланина в клеточных оболочках, температуры.
В связи с тем что меланиновые пигменты представляют собой высокосопряженные биополимеры, построенные из частично конденсированных фенольных и индольных фрагментов, и обладают полупроводниковыми и фотопроводящими свойствами (Forrest et al., 1966; Potts, Au, 1968; Blois, 1975) можно предположить, что при действии света в пигменте происходят обратимые процессы переноса электронов, приводящие к образованию анион- и катион- радикальных центров — «электронов» и «дырок». Способность низкомолекулярных фенольных, индольных и хиноидных соединений вступать в темновые и фотохимические окислительно-восстановительные реакции хорошо известна (Ершов и др., 1972; Feitelron, Hayon, 1973; 1973; Ельцов и др., 1977).
Поглощение кванта света пигментом переводит электрон из области I в зону проводимости или в локализованное состояние с достаточно высокой энергией. Потеряв-часть энергии, электрон локализуется затем в области II или туннелирует в нее, что приводит к образованию ион-радикальной пары. Очевидно, эффективность такого процесса тем выше, чем больше энергия возбуждающего света.
Установлено, что лучи длиной волны от 200 до 900 нм вызывают фотоэффект в изолированном меланине, причем наименьшая энергия длинноволнового излучения составляет 1,3 эВ. Некоторое увеличение скорости образования ПЦ с ростом температуры на начальных стадиях облучения можно связать с вкладом температурно зависимого (Григоров, Чернавский, 1972) туннельного переноса электронов. Образование иона-радикалов в органических веществах, и в том числе биополимерах (Багдасарьян, 1976; Львов и др., 1977), происходит большей частью по двухквантовому механизму, характеризующемуся квадратичной зависимостью скорости (v) накопления ПЦ от интенсивности (I) падающего света. Однако в случае меланина мы наблюдали пропорциональную зависимость v от I при изменении I в 3 или 10 раз на начальных участках кинетических кривых, что согласуется с предположенным выше одноквантовым механизмом.
Следует отметить, что «насыщение» при низких температурах (—100 — 120° С) нельзя объяснить обычным поверхностным разогревом образцов грибов и изолированного меланина поскольку действие теплового излучения ламп ДРШ-1000 или К-30-400 (фильтр ИКС-3) на облученный видимым или УФ-светом меланиновый пигмент не приводило к заметному уменьшению сигнала ЭПР. Возможность «насыщения» из-за гибели ПЦ (по схеме (+) + (—) → рекомбинация) не согласуется с тем, что замена, коротковолнового света красным на близком к насыщению участке кинетической кривой вызывает не уменьшение, а дальнейший медленный рост сигнала ЭПР.
Как следует из приведенных выше данных, при температуре 0° С темновая рекомбинация фотоиндуцированных ПЦ происходит очень быстро. Хотя облучение и не приводит при этом к заметному повышению концентрации ПЦ, трудно предположить, что при повышении температуры «выключались» первичные фотофизические процессы (1—4), генерирующие ПЦ. Таким образом, полученные нами данные позволяют предположить, что при обычных условиях действие света (А, 800 нм) на меланиновый пигмент вызывает процессы переноса электронов. Полупроводниковые свойства меланина обеспечивают обратимость этих процессов и предотвращают необратимые химические изменения пигмента, защищающего клетку от действия УФ и видимого света.
В дальнейшем исследовали механизм переноса электронов в меланине (Мележик, 1980). Наиболее четкое увеличение сигнала ЭПР меланинового пигмента наблюдалось для мутанта С. transchelii К-1, поэтому исследование проведено на нем. Установлено, что фотоиндуцированный сигнал ЭПР довольно быстро уменьшался при размораживании образна. Кинетика изменения сигнала описывалась в координатах интенсивность — логарифм времени прямой линией. Зависимость такого типа характерна для процессов дальнего туннельного переноса электронов в твердых телах. Путем сопоставления наблюдаемой ширины сигнала ЭПР фотоиндуцированных ПЦ и расчетного уширения за счет диполь-дипольного взаимодействия неспаренных электронов в твердой матрице, была сделана оценка среднего расстояния между фотоиндуцированными ПЦ. Оно составляет несколько десятков А, что согласуется с механизмом возникновения и гибели ПЦ вследствие туннельного переноса электронов.
Несмотря на то что влияние состава атмосферы на кинетику фотопроцессов изолированного меланина практически не наблюдалось, для некоторых меланизированных грибных конидий такое влияние в ряде случаев существует. По всей вероятности, в присутствии кислорода фотопроцессы в пигменте in vivo более сложны и обратимы не полностью. Эти вопросы требуют дальнейшего изучения, однако можно отметить, что у чувствительных к УФ-лучам Oidiodendron cerealis и мутанта К-1, отличающихся пониженным содержанием меланинового пигмента, величина фотоиндуцированного сигнала ЭПР пигмента и скорость его темновой релаксации больше, а влияние состава атмосферы при освещении выражено сильнее, чем у исходного Cladosporium transchelii и УФ-устойчивого мутанта Ч-1. Кроме того, изучение фотореактивации у С. transchelii и его крайних по пигментации мутантов Ч-1 и БМ и зависимость этого процесса от степени пигментации культуры свидетельствуют об автономности светозащитной реакции меланинового пигмента (Жданова та iн., 1977).
Проведенное исследование раскрывает причины высокой устойчивости меланина и меланинсодержащих объектов к действию света.
Источник: Н. Н. Жданова, А. И. Василевская. Экстремальная экология грибов в природе и эксперименте. Киев: Наук. думка, 1982