С. Н. Виноградский ввел понятия о зимогенной и автохтбнной микрофлоре почвы.
К первой группировке он относил микроорганизмы, разрушающие свежие органические остатки растительного и животного мира, попадающие в почву. Ко второй причислялись микроорганизмы, разрушающие перегнойные соединения почвы. Виноградский предполагал, что представители автохтонной группировки не растут на обычных питательных средах, но они должны составлять многочисленную группу. Этим он пытался объяснить разрыв между показаниями прямого микроскопического анализа почвы и метода учета микроорганизмов на обычных питательных средах.
В оригинальных работах самого Виноградского представления об автохтонной микрофлоре не были детализированы, но материалы значительной группы исследователей позволяют в настоящее время высказать ряд определенных положений о микроорганизмах, способных разрушать сложные циклические перегнойные вещества. Совокупность этих работ приводит к заключению, что процесс деструкции перегнойных соединений могут осуществлять отдельные представители различных систематических групп микроорганизмов. Вместе с тем несомненным являлось также то, что потенциальная способность к разрушению перегноя у отдельных микробов различна. В наших экспериментах мы стремились установить наиболее активных возбудителей данного процесса и изучить их свойства.
Нам представлялось, что интересные сведения об автохтонной микрофлоре могут дать почвы, длительное время бывшие в парующем состоянии. Подобные фоны имеются на Опытном поле Сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева, где в 1912 г. Д. Н. Прянишниковым был заложен на дерново-подзолистой почве стационарный длительный полевой опыт. В его вариантах имелись делянки бессменного пара, бессменной культуры одного растения и севооборота. Сопоставление микрофлоры почв, использовавшихся различным образом длительное время, могло дать определенные указания по интересующему нас вопросу. Мы считаем целесообразным сопоставить два варианта — бессменный пар и бессменный посев ржи. В первом случае органическое вещество растительного происхождения поступало в почву в крайне ограниченном количестве. Источником его могли быть в основном немногочисленные сорняки и микроскопические водоросли. Здесь должны были развиваться микроорганизмы, разлагающие перегной или питающиеся продуктами его разложения. Под бессменной рожью почва обогащалась ежегодно корневыми и пожнивными остатками и создавались весьма благоприятные условия для группировки зимогенной микрофлоры.
В почве, занятой бессменным посевом ржи, в которую ежегодно поступают растительные остатки, содержится значительно больше бактерий, бацилл и актиномицетов. Можно сделать вывод, что в основном эти группы принадлежат к зимогенной микрофлоре. Число сапрофитных бактерий в парующей почве сильно редуцируется. Из имеющихся бактерий здесь доминируют представители рода Pseudomonas. Можно допустить, что некоторые из них могут разлагать перегной. Ниже будет показано, что это предположение вполне подтверждается. Некоторая часть бактериальной флоры может здесь существовать за счет продуктов распада перегноя, а также быть обеспеченной небольшим количеством остатков вырастающих сорняков и микроскопических водорослей.
Из отдельных видов учтенных микроорганизмов в парующей почве сильно редуцировалось число клеток Bac. mycoides, Bac. cereus и Bac. megaterium. Редуцировалась также численность актиномицетов. Это тоже типичные сапрофитные микроорганизмы.
Интересно то, что в почве длительного пара мало изменилась численность микофлоры. Однако в основном остались только представители рода Penicillium. В литературе вообще имеются указания на способность этих микроорганизмов ассимилировать сложные соединения, в том числе перегной.
Не исключена возможность того, что в пару остались виды Реnicillium, способные разлагать перегной или усваивать продукты его распада. Ряд грибных видов, как-то: Fusarium, Trichoderma и Mucor — в почве без растительности практически исчезли. Эти микроорганизмы следует отнести к зимогенным.
Небезынтересные результаты были получены при анализе почв на бедной агаризованной среде, имевшей соли по прописи, предложенной Виноградским для второй стадии нитрификации. Источник углерода не давался. Микроорганизмы могли здесь довольствоваться лишь небольшими количествами органических соединений, примешанных к агару. На этой среде вырастает довольно много организмов и, что особенно важно, на ней легко определяются колонии актиномицетов и проактиномицетов (Nocardia). На обычных богатых средах большинство проактиномицетов образует нехарактерные по морфологии колонии, практически тождественные колониям бактерий. Это затрудняет диагностику группы Nocardia. На бедной питательной среде проактиномицеты образуют мицелиальный ободок, наличие которого облегчает выявление этой группы микроорганизмов. Здесь же легко определяются представители рода Micromonospora. Полученные данные о наличии актиномицетов и близких к ним организмов (в %) в исследованные почвах приводятся ниже.
Как видно, вполне подтверждается угнетение актиномицетов в парующей почве и увеличение относительного содержания Nocardia и Micromonospora. Абсолютное увеличение численности наблюдается у Nocardia. Если в почве бессменного пара на 1 г имеется около 200 тыс. зародышей Nocardia, то в почве бессменной ржи только 136 тыс. Абсолютная численность Micromonospora также возросла. В почве бессменного пара имелось около 67 тыс. клеток на 1 г почвы. В почве бессменной ржи — около 20 тыс. Исходя из полученных данных, можно допускать, что некоторые представители Nocardia и Micromonospora могут быть отнесены к автохтонной микрофлоре. Более подробно описанный опыт разобран в работе Мишустина и Теппер.
Изложенные факты побуждают с должным вниманием отнестись к микроорганизмам рода Nocardia. Эти микроорганизмы, как представители автохтонной микрофлоры, были подробно изучены Теппер. Здесь же мы кратко излагаем наиболее интересные в аспекте нашей работы сведения.
Наличие микроорганизмов рода Nocardia в разных почвах было выявлено при использовании бедной питательной среды. Проведенные наблюдения показали, что численность нокардий в почве подвержена сезонным изменениям. Максимальное число их клеток обычно наблюдается весной. Летом, особенно в периоды дефицита увлажнения, отмечается резкое уменьшение числа клеток. В общем сезонная динамика численности Nocardia повторяет динамику влажности почвы.
Практически все почвы имеют микроорганизмы рода Nocardia. Однако разные прчвы неодинаково богаты ими. В почвах южной зоны, за исключением красноземов, имеющих пониженное значение pH, абсолютная численность данных микроорганизмов выше. Это связано с нарастанием в южных почвах и общей численности микробного населения.
Отмечается также, что в почвах с развитыми мобилизационными процессами, где происходит энергичный распад перегноя, относительное число Nocardia увеличивается. Например, для торфяно-болотных почв мы имеем следующие показатели по наличию в них Nocardia: целина содержит 1,9% от общей численности микробов; обрабатываемый торфяник — 11,9%.
Орошение, вызывающее активацию микробиологических процессов, сказывается на увеличении и относительной численности Nocardia: неорошенная каштановая почва имеет — 16% Nocardia, орошаемая — 25.
Отмечается также, что в почвах, где в силу природных условий происходит аккумуляция перегноя, Nocardia представлены бедно. Например, в торфяно-болотной почве их относительная численность равна 1,9%, а в черноземах — 2,9—6,3%. В то же время в дерново-подзолистых почвах, где перегной разрушается быстрее, относительное содержание Nocardia бывает обычно выше 10% от учитываемой численности микроорганизмов.
Изложенное позволяет предположить, что в почвах с повышенным содержанием Nocardia должны протекать процессы, вызывающие распад перегноя. Этот вывод подтверждается экспериментально.
Организмы рода Nocardia, выделенные из исследованных почв, были подробно изучены Е. З. Теппер. Некоторые культуры были описаны как новые виды. Это были N. mucosum, N. symbiotica, М. aeromycelium, N. rubra var. humicola. Проделанная работа позволила выявить спектр видов Nocardia, свойственных отдельным’типам почв. Создается впечатление, что род Nocardia имеет широкий ареал распространения, но определенные виды Nocardia все же обильнее представлены в тех или иных почвах. Так, например, дерново-подзолистые почвы более богаты N. mucosum и N. corallina, черноземы — N. symbiotica, а каштановые почвы — N. citrea и N. symbiotica. Довольно многочисленные факты позволяют утверждать, что случаи усиленного распада перегноя в почве коррелятивно связаны с размножением N. corallina и N. rubra.
Были изучены физиологические свойства более чем 50 культур Nocardia, выделенных из разных почв. Установлено, что протеиназа у них или отсутствует совсем, либо слабо активна. Поэтому Nocardia не развиваются на белковых средах. Они хорошо усваивают многие аминокислоты, пептон и минеральные соединения азота.
Хорошее развитие микроорганизмов рода Nocardia наблюдается на глюкозе, ряде спиртов и солей органических кислот. Крахмал и клетчатка не усваиваются. Более половины культур способно размножаться на углеводородах. Большинство краснопигментных культур ассимилирует бензойную, салициловую, протокатеховую кислоты и ванилин. Эта функция свойственна и некоторым другим культурам (N. mesentericus, N. mucosum).
Способность микроорганизмов рода Nocardia разлагать гуминовую кислоту устанавливалась опытами на жидкой питательной среде. Как основа бралась среда Виноградского для нитрификаторов (без источника азота). К ней добавлялся раствор гуминовой кислоты и в отдельных вариантах небольшие дозы KNO3 (мг), сахара или дрожжевого экстракта.
После заражения стерильных сред культурами Nocardia они выдерживались 4 месяца в термостате при 28—30°. Показателями распада гуминовой кислоты являлись нарастание клеточной массы (азот которой определялся по методу Кьельдаля) и установление количества израсходованной гуминовой кислоты (определение углерода после осаждения гумуса по методу Н. В. Тюрина). Распад гуминовой кислоты под влиянием Nocardia несомненно имел место. Прибавка небольшой дозы дрожжевого автолизата несколько ускоряла процесс, а добавление глюкозы или KNO3 замедляло. Разложение гумата натрия Nocardia rubra.
Аналогичные данные были получены для ряда других культур (N. corallina, N. salmonicola).
Наряду с отмеченными опытами исследовалась способность ряда культур нокардии использовать гумат в акте дыхания, для чего были проведены опыты в аппарате Варбурга. Введение в среду, не содержащую органических соединений, гумата сильно повысило энергию дыхания Nocardia. Это подтверждает ассимиляцию микроорганизмами гумата. Еще более энергично процесс шел при добавлении в среду глюкозы. Таким образом, проведенные опыты показывают, что многие культуры Nocardia способны минерализовать почвенный перегной. Эта способность наиболее часто проявляется у красно-пигментированных культур.
В нашей лаборатории В. И. Аристарховой была изучена смена форм проактиномицетов при распаде разных органических веществ. Приводится один из опытов, в котором исследовался процесс минерализации технического лигнина в песке, удобренном минеральными солями и инфицированном почвенной суспензией. Из рисунка видно, что в первый период развивались, наряду с другими микроорганизмами, бесцветные Nocardia, а позднее доминировали формы, имеющие красный пигмент. Это подтверждает, что к группировке автохтонной микрофлоры должны быть в основном отнесены красноокрашенные представители рода Nocardia.
Увеличение численности микромоноспор в парующей почве дает повод думать об участии этих микроорганизмов в разрушении гумуса. Из литературных источников известно, что некоторые микромоноспоры разлагают лигнин. Их способность минерализовать перегной все же требует подтверждения.
Микроорганизмы, разлагающие перегной почвы, мы стремились также выявить, проводя лабораторные опыты, в которых жидкие среды, содержащие гуминовые соединения, как единственный источник органического вещества, инокулировались почвенной болтушкой. Наблюдая за развитием микрофлоры и обесцвечиванием перегноя, можно было выявить состав микрофлоры, принимающей участие в разложении перегноя. Для более точного установления возбудителей процесса ряд культур микроорганизмов выделялся для изучения их физиологических свойств и систематического положения.
Результаты работ, выполненных в лаборатории автора, опубликованы в ряде статей. Здесь мы даем лишь основные выводы из проделанных экспериментов.
Было выявлено, что основной микрофлорой, разлагающей перегной в жидких средах, являются представители рода Pseudomonas. Две наиболее часто встречавшиеся культуры были определены как Ps. fluorescens и Ps. geniculatus. Очевидно, первая культура является разновидностью типичной формы Ps. fluorescens, которая не разлагает перегнойные соединения. Были также выделены некоторые другие культуры рода Pseudomonas, идентифицировать которые с ранее описанными культурами не удалось. Произведенная проверка показала, что все эти организмы способны усваивать гуминовую кислоту как единственный источник азотного и углеродного питания. Можно заключить, что представители рода Pseudomonas могут быть причислены к автохтонной микрофлоре почвы. Полевой опыт, уже описанный нами выше, также подтверждает факт обильного наличия Pseudomonas в парующей почве. Ассимиляция гуминовой кислоты культурами Pseudomonas была подтверждена опытами в аппарате Варбурга.
Нами был поставлен опыт по изучению влияния легкодоступных микробам органических соединений на распад гуминовой кислоты культурами Pseudomonas. Ниже указывается процент минерализованного гумата за 2-месячный срок.
Как показывают данные, прибавка к среде глюкозы или маннозы заметно усилила разложение гуминовой кислоты. Это было связано с более интенсивным размножением микроорганизмов. Очевидно, отмеченный факт может быть объяснен явлением «соокисления».
Таким образом, культуры Pseudomonas реагировали на введение углеводов совершенно иначе, чем культуры Nocardia.
Проведенные эксперименты показали, что выделенные чистые культуры Pseudomonas довольно сильно отличаются по их способности разлагать гуминовую кислоту. Более энергичным из них была свойственна высокая пероксидазная активность.
В 1965 г. В. Р. Вильямсом была предложена методика дифференциального разделения перегнойных соединенинй с помощью колоночной хроматографии. Колонки заряжались активированным углем и Аl2O3. Эта методика дала возможность получать ряд фракций перегнойных соединений. Одна из них — «лигиофульвоновая» кислота — имела молекулярный вес примерно в 2 раза меньший по сравнению с гуминовой кислотой. Другая фракция — «фульвановая» кислота, обладающая малым молекулярным весом и низким содержанием углерода (26%), может рассматриваться) как «прогумусовое» соединение. Имелись и другие фракции, которые в данном случае для нас интереса не представляют.
Проведенные эксперименты показали, что чем выше молекулярный состав перегнойного соединения, тем медленнее на нем размножаются микроорганизмы и тем более оно стабильно против их воздействия.
Из полученных в последнее время микроорганизмов перегнойные соединения могут разлагать микроорганизмы рода Mycobacterium, которые относились С. Н. Виноградским к роду Bactoderma.
Не исключена возможность, что интересующая нас функция свойственна и некоторым так называемым «новым формам» микроорганизмов, которые были выявлены в последнее время.
Таким образом, перегнойные соединения почвы могут разлагаться весьма различными микроорганизмами — бактериями, представителями семейства актиномицетов (Nocardia, микобактериями и т. д.), грибами и др.
Все отмеченные микробы являются сапрофитами, но обладают способностью разлагать сложные циклические соединения. Поэтому, нам кажется, в понятие «автохтонной» микрофлоры следует вкладывать представление о сапрофитах (зимогенных микроорганизмах), обладающих более мощным ферментативным аппаратом, позволяющим разрушать полициклические соединения, к которым относится и перегной.