Прежде чем приступить к описанию хорошо известных и легко выполнимых методов приготовления микроскопических препаратов мелких членистоногих (клещей, тлей, щитовок, трипсов, галлиц и др.), необходимо сказать о наиболее важных вспомогательных средствах (предметные и покровные стекла) и о значении заключающих сред.
Для получения микроскопических препаратов необходимы предметные и покровные стекла. Между ними находится среда, в которую погружают препарируемого вредителя.
Предметные стекла представляют собой прямоугольные пластинки длиной 75 и шириной 25 мм. Их толщина должна составлять 1 мм. Для изготовления безупречных препаратов пригодны лишь стекла без искривлений, волнистостей и пузырьков.
Размер покровных стекол может быть различным. Наряду с наиболее распространенным форматом 18X18 мм применяют покровные стекла размером 15X15 и 10X10 мм. Особое внимание следует уделять толщине покровных стекол, так как на нее оптически скорректированы объективы микроскопов (все объективы Цейсса скорректированы на толщину покровного стекла 0,17 мм). При применении ахроматических сухих объективов и слабых апохроматов (увеличение 10Х и 20Х) возможны незначительные отступления от предписанной толщины (0,17 мм), но у ахроматических иммерсионных объективов, как и у всех апохроматов с большим увеличением, это привело бы к ухудшению качества просмотра. То же относится к покровным стеклам с царапинами, искривлениями и воздушными пузырьками. Поэтому качество покровных стекол целесообразно подвергать проверке, отбирая их по толщине с применением специального измерителя или микрометра и отбраковывая дефектные стекла.
Перед приготовлением препаратов как предметные, так и покровные стекла необходимо тщательно очистить с помощью чистой мягкой льняной тряпочки. При более сильном загрязнении очистку проводят спиртом, аммиаком или ксилолом. Стекла, помутневшие от промышленных примесей, можно положить на несколько дней в смесь бихромата калия и серной кислоты, а затем ополоснуть дистиллированной водой и спиртом.
Заключающие среды должны уменьшать показатель преломления воздуха-(1,0) и объекта (для хитиновой кутикулы 1,5—1,6), чтобы пучки лучей оставались в поле зрения микроскопа и могли быть восприняты наблюдателем. Кроме того, среды должны обладать консервирующими свойствами, защищая объект от гнили и плесени, а также предохранять его от пыли, высыхания и сморщивания. Хорошими средами для клещей и насекомых являются водорастворимые камедистые и водонерастворимые смолистые вещества. Их преимущества и недостатки подробно рассмотрены при обсуждении отдельных методов.
Препараты клещей для определения. При приготовлении препаратов клещей (паутинных, мягкотелых, галловых) в первую очередь следует провести осветление объекта, т. в. сделать его прозрачным, чтобы под микроскопом в проходящем свете можно было четко установить важные для систематики признаки. В качестве осветляющего средства обычно применяют 10%-ную калийную щелочь, 50—100%-ную молочную кислоту или смесь глицерина и ледяной уксусной кислоты (1:4).
Живых клещей помещают на предметное стекло в каплю одного из осветляющих средств и накрывают покровным стеклом. Повторное осторожное нагревание над пламенем горелки или длительное нагревание на тепловой панели (60 °С) ускоряет осветление. При использовании в качестве осветляющей среды молочной кислоты или смеси глицерина с ледяной уксусной кислотой одновременно с осветлением происходит распрямление клещей и их нередко поджатых ножек — преимущество, которое существенно облегчает определение. Если для осветления используют калийную щелочь, то распрямление клещей можно вызвать путем добавления воды после нагревания.
Постоянные препараты клещей. Для постоянных микропрепаратов клещей пригодны различные, в первую очередь водорастворимые заключающие среды, содержащие камедь. Живых клещей (мягкотелых, галловых) помещают в каплю среды на предметном стекле. Если они непрозрачны (паутинный клещ), то предварительно их следует осветлить. Осветляющими средствами служат 19—30%-ный раствор калийной щелочи или 50—100%-ная молочная кислота. Для их удаления объект ополаскивают в нескольких сменах дистиллированной воды и затем погружают непосредственно в заключающую среду. Описание некоторых сред дано ниже.
Для приготовления смеси Берлезе 30 г гуммиарабика растворяют в 30 мл дистиллированной воды. Приблизительно через три дня добавляют 20 мл глицерина и 200 г кристаллов хлоралгидрата. Еще через три дня вязкотекучую жидкость фильтруют, что также занимает несколько дней. Готовую к употреблению смесь Берлезе хранят в бутылках с винтовыми колпачками.
Раствор Фора по составу аналогичен смеси Берлезе. Он состоит из 30 г гуммиарабика, 50 мл дистиллированной воды, 20 мл глицерина и 50 г хлоралгидрата. Готовят раствор так же, как смесь Берлезе.
Реагент Хойера имеет следующий состав: 50 г гуммиарабика, 50 мл дистиллированной воды, 30 мл глицерина и 125 г хлоралгидрата. Для приготовления этой среды действительны указания по получению смеси Берлезе.
Поливиниллактофенол готовят путем добавления поливинилового спирта к нагретой дистиллированной воде при постоянном помешивании до образования сиропообразного раствора. Через несколько часов раствор становится прозрачным (при необходимости его вновь подогревают на водяной бане). После охлаждения к 5 частям поливинилового раствора прибавляют по 2 части фенола и молочной кислоты. Эту среду также хранят в склянках с винтовыми колпачками.
Поместив клещей на предметном стекле в одну из описанных сред, осторожно накладывают покровное стекло. Полученный препарат рекомендуется прогреть в течение 2 ч на плитке или в термостате примерно до 60 °С. При этом происходит дальнейшее осветление клещей и распрямление поджатых ножек.
Примечание. Во всех водорастворимых средах содержится около 50% летучего растворителя. Поэтому даже при тщательном хранении постоянные препараты со временем могут сильно высохнуть. Для замедления этого процесса через полгода после приготовления препаратов покровные стекла следует обвести специальным лаком.
Постоянные препараты насекомых. Если приготовление препаратов клещей — за исключением их осветления — большей частью происходит без дорогостоящих предварительных процедур, то для насекомых, которые, как правило, обладают более хитинизированным покровом, чаще всего необходима мацерация, а иногда и обезжиривание.
Мацерация служит для размягчения мягких тканей, в первую очередь мышц, и для омыления жиров. В качестве мацерирующих веществ пригодны растворы щелочей. Слабые щелочи (5— 10%) мацерируют сильнее, однако гораздо интенсивнее воздействуют на хитин, чем концентрированные щелочи (20—30%-ные). Поэтому последние следует рекомендовать для нежных насекомых, например тлей. Чтобы ускорить мацерацию, можно также нагреть щелочь до 60 °С или же довести ее до точки кипения (медленно!). Однако при этом следует учитывать частое выцветание животных, что у темноокрашенных трипсов нередко даже желательно.
Тлей перед мацерацией рекомендуется обезжирить с помощью смеси 96%-ного спирта и четыреххлористого углерода (1:1). Насекомых оставляют в этой смеси на 2—4 дня, меняя ее 2—3 раза, затем ополаскивают 80%-ным спиртом и мацерируют в калийной щелочи.
Мацерированных насекомых нужно перенести в дистиллированную воду, чтобы удалить щелочь и омылившееся содержимое тела. Для ускорения процесса диффузии насекомых можно надрезать по бокам или проколоть тонкими иглами. Дальнейшая обработка зависит от выбора заключающей среды.
Если для приготовления постоянных препаратов выбирают водорастворимые камедистые вещества, входящие в состав смеси Берлезе, раствора Фора или реагента Хойера, то насекомых переносят из дистиллированной воды на 5—10 мин в разведенную молочную кислоту или разведенный глицерин, а затем погружают на предметном стекле в заключающую среду. Приготовление препарата заканчивается осторожным наложением покровного стекла.
Если же в качестве заключающей среды используют водонерастворимые смолистые вещества, например канадский или нейтральный бальзам, то в этом случае прежде всего необходимо провести обезвоживание объекта. С этой целью насекомых последовательно помещают в 50%-, 70%-, 80%-ный и абсолютный спирт каждый раз на 1—2 часа, затем быстро опускают в промежуточную среду (ксилол или гвоздичное масло) и наконец погружают в каплю канадского или нейтрального бальзама на предметном стекле и накладывают покровное стекло. Следует отметить, что насекомых, хранившихся в 70%-ном спирте, перед погружением в бальзам обрабатывают только 80%-ным и абсолютным спиртом и ксилолом или гвоздичным маслом.
Примечание. Приготовление микроскопических препаратов с применением водорастворимых камедистых сред (смесь Берлезе, раствор Фора, реагент Хойера) обладает большим преимуществом: насекомых можно перевести в заключающую среду живыми, из разведенной молочной кислоты, глицерина или из 80%-ного спирта без предварительной дорогостоящей обработки. Недостатком же метода является сморщивание объектов, постепенно развивающееся вследствие испарения летучих компонентов среды. В результате качество препаратов ухудшается.
Относительно высокие затраты на мацерацию, обезжиривание, обезвоживание при применении водонерастворимых смолистых сред (канадский или нейтральный бальзам) уравновешиваются почти неограниченной стойкостью постоянных препаратов. Поэтому в тех случаях, когда увеличение расходов на приготовление препаратов возможно, следует отдавать предпочтение заливке насекомых канадским или нейтральным бальзамом.
Этикетирование и хранение постоянных препаратов. Постоянные препараты лишь тогда выполняют свою роль, когда они правильно оформлены. Для этого обычно используют бумажные этикетки, наклеивая их с одной или с обеих сторон на предметное стекло. Наклеивать этикетки следует тщательно, так как без надписи объект теряет научное значение.
На этикетках должны быть приведены следующие данные: точное видовое наименование объекта, символ пола, фамилия того, кто определил насекомое, вид и дата определения. Рекомендуется также приводить дополнительные сведения: наименование растения-хозяина, место отлова, заключающую среду и дату приготовления препарата.
Во время, высушивания, длящегося несколько недель, постоянные препараты обязательно должны храниться в горизонтальном положении и в пыленепроницаемом месте. Для этого пригодны специальные папки на 20 препаратов или коробки на 50 и 100 препаратов. В коробках постоянные препараты оставляют на длительное хранение.