Данные о наличии микротрубочек у спирохет — пиллотин получены тремя разными методами. Во-первых, это прямое электронно-микроскопическое наблюдение фиксированных глутаральдегидом микротрубочек у Pillotina, Diplocalyx и родственных видов спирохет. Во втором методе использовались флуоресцентные антитела к различным тубулинам эукариот. Эти антитела прямо добавляли к разнообразным препаратам спирохет и наблюдали их распределение с помощью флуоресцентного микроскопа. Третий метод состоит в выделении из спирохет растворимых белков, мигрирующих в полиакриламидном геле вместе с тубулином из мозга млекопитающих. Предполагаемый тубулиноподобный белок был выделен из содержимого кишечника термитов, из фракций, где находились только прокариоты, главным образом те крупные спирохеты, у которых наблюдались микротрубочки.
Приведены электронные микрофотографии представителей трех родов спирохет из кишечника термитов. В норме эти спирохеты всегда подвижны. В некоторых случаях на срезах этих пиллотин, взятых из подземных термитов Reticulitermes flavipes и R. hesperus и питающихся сухой древесиной термитов Kalotermes (Incisitermes) schwartzi, I. minor и Pterotermes Occidentis, были видны микротрубочки. Эти микротрубочки обычно уложены в продольном направлении, и часто кажется, что они повторяют спиральные контуры спирохеты; однако они видны далеко не на всех срезах и немногочисленны. Сходные, если не идентичные, внутрицитоплазматические микротрубочки наблюдались у неидентифицированных длинных, тонких безжгутиковых бактерий, выделенных от термитов. Микротрубочек не находили у мелких трепоземоподобных спирохет, а также у размножающихся в культуре спирохет Treponema reiteri. Однако более мелкие трубочки описаны у Leptonema.
Антитела к белкам микротрубочек были получены несколькими исследователями. Эти антитела, связанные с флуоресцеином, использовались в качестве цитологического маркера для флуоресцентной микроскопии. Этот метод сходен с тем, который применяли Фуллер и его сотрудники для идентификации тубулина митотического веретена. В результате были получены предварительные данные, указывающие на присутствие у спирохет из Kalotermes schwartzi и Pterotermes occidentis материала, дающего перекрестную реакцию с антителами к тубулину.
По всей длине крупных спирохет регулярно наблюдалась интенсивная флуоресценция. Положительную реакцию давали также длинные палочковидные бактерии. Свечение спирохет было сравнимо по интенсивности со свечением ундулиподий полимастигот и гипермастигот, неизбежно присутствующих в препаратах задней кишки термитов. Столь интенсивная флуоресценция заставляет предполагать, что пиллотины и неидентифицированные палочковидные бактерии содержат значительные количества тубулина, не организованного в трубочки.
Хотя для проверки того, что флуоресценция обусловлена именно тубулином, было поставлено много контролей, результаты опытов с иммунофлуоресценцией нельзя считать бесспорными. Для более прямого биохимического сравнения предполагаемого тубулина спирохет с хорошо изученными тубулинами эукариот был применен электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Однако эта работа не дала однозначных результатов из-за невозможности выращивания пиллотин в чистой культуре.
Предпринималось много попыток выделить эти спирохеты из поверхностно стерилизованных термитов, но без достаточного успеха. Опубликован состав лучшей из использованных сред, на которой удается поддерживать небольшое число активно движущихся крупных спирохет в смешанной культуре в течение 3-5 дней. Эта среда далеко не адекватна. Однако в герметизированных препаратах для микроскопирования пиллотины выживали в течение суток и более, что позволило изучить их поведение. Дольше других выживали спирохеты, выделенные из крупных термитов с более концентрированным содержимым кишечника.
Так как нормальные термиты содержат огромные количества спирохет, их удается отделить от остальных микробов кишечника дифференциальным центрифугированием. Растворимые белки из спирохет, жгутиковых и тканей термитов исследовали стандартными методами электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. В этих опытах использовали максимально очищенную фракцию спирохет из термитов каждого вида. Во всех случаях, кроме тех, где исследовали чистую культуру трепонемы Рейтера или же единственным источником белка служил срез кишки термита, среди примерно дюжины выявленных полос была интенсивная до л оса белка, мигрирующего вместе с тублином из мозга млекопитающего. Но это указывает лишь на присутствие в препаратах спирохет белка, сходного с тубулином по заряду и молекулярной массе; доказать, что это действительно тубулин, можно только с помощью более прямых биохимических методов.
Те же методы использовались для поиска белка микротрубочек у Treponema reiteri, выращенной в аксенической культуре. Была сделана попытка выявить флуоресценцию спирохет, обработанных антителами к тубулину мозга, а белок трепонем выделяли и подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле. Кроме того, в опытах с этими трепонемами применяли подофиллотоксин, β-пельтатин и винбластин — вещества, ингибирующие полимеризацию белков микротрубочек. Treponema reiteri не флуоресцировала при обработке антителами к тубулину, у нее не оказалось белка, мигрирующего вместе с тубулином, и ее рост не подавлял ни один из исследованных антимитотических агентов. Эти результаты согласуются с очень четкими данными ультраструктурного исследования, при котором в протоплазматических цилиндрах этих спирохет не было найдено микротрубочек с диаметром 20 нм. Трубочки и тубулиноподобные белки, несомненно, имеются не у всех спирохет; свойственны ли они всем пиллотинам или каким-либо другим прокариотам, пока неизвестно.
В этих исследованиях может быть несколько источников ошибок. Прокариоты могут содержать отличный от тубулина белок с очень близкой молекулярной массой, мигрирующий при гель-электрофорезе вместе с тубулином; флуоресценция может быть артефактом; микротубулярные структуры могли возникнуть конвергентно, и их сходство с соответствующими структурами эукариот может быть чисто случайным. Пожалуй, еще труднее исключить возможность того, что тубулин получен пиллотинами от протестов в результате переноса некой плазмиды в перенаселенном кишечнике термита. Окончательно решить вопрос смогут только детальные биохимические исследования на чистых культурах спирохет, содержащих микротрубочки. Однако гипотезу о том, что ундулиподиальная система эукариот была приобретена в результате ассоциации со спирохетами и лишь позднее сильно модифицирована и использована в механизме митоза, можно проверить и с помощью косвенных данных.
Можно сделать несколько предсказаний, определенно отличающих симбиотическую гипотезу от гипотезы прямой филиации. Так, должны быть найдены спирохеты, содержащие тубулин, гомологичный тубулину обычных микротрубочек эукариот. Должна быть обнаружена гомология нуклеотидных последовательностей нуклеиновых кислот, участвующих в репликации ЦМ, и каких-то нуклеиновых кислот соответствующих спирохет. Тубулина не должно быть в «микротрубочках» клеточной стенки цианобактерий. Быть может, найдутся даже такие спирохеты, которые содержат тубулин, связывающий колхицин, или дублеты микротрубочек, организованные в структуру с девятилучевой симметрией! Во всяком случае вероятность того, что некоторые спирохеты содержат тубулин, образующий внутриклеточные микротрубочки, за последнее время значительно возросла.
Источник: Л. Маргелис. Роль симбиоза в эволюции клетки. Пер. В.Б. Касинова, Е.В. Кунина. Под ред. Б.М. Медникова. Издательство «Мир». Москва. 1963