При изучении влияния минеральных компонентов среды на биосинтез необходимо иметь в виду, что практически мы всегда вносим в среду значительное и подчас неучтенное их количество.
Возможными источниками минеральных ионов могут быть химические реактивы, посевной материал, вода, посуда и пр. При анализе некоторых химических веществ спектрографическим методом было обнаружено, например, в глюкозе присутствие в виде примесей семнадцати элементов, в сульфате магния и сульфате цинка — по девяти элементов. Вода обычно наиболее богата солями железа, кальция и магния. Для специальных исследований при изучении минерального обмена рекомендуется пользоваться дважды дистиллированной водой.
Источником загрязнения сред минеральными ионами может быть стеклянная посуда, в частности колбы, где происходит культивирование. Известно, что стекло подвергается выщелачиванию, при этом некоторые ионы — натрий, калий, магний, кальций — могут переходить из стекла в среду. Рекомендуют применять колбы из такого стекла, которое практически не подвергается выщелачиванию. Наилучшим в этом отношении является кварцевое стекло, однако из-за дороговизны в практике применяют его редко. Удовлетворительным для работы можно считать стекло «Пирекс». Имеется также ряд предложений по применению посуды из специальной пластмассы.
Все известные методы по очистке питательных сред от примесей тяжелых металлов можно разделить на сорбционные и экстракционные. В качестве сорбентов используют древесный уголь, мел, окись алюминия. Для удаления некоторых металлов используется также способность дифенилтиокарбазона (дитизона) и 8-гидроксихинолина (оксин) к образованию с металлами окрашенных комплексных соединений. Реакция с названными веществами позволяет уловить 0,0001—0,0005 мг цинка, меди, никеля, кобальта, свинца, кадмия, железа, висмута. Как правило, наибольшее количество тяжелых металлов обнаруживается в углеводах. В ряде случаев бывает вполне достаточным проводить удаление тяжелых металлов только из углеводов.
Минеральные компоненты среды имеют различное физиологическое значение. Одним из существенных свойств их является влияние на физико-химическое состояние коллоидов протоплазмы. Под воздействием неорганических солей поверхностный слой клетки непрерывно претерпевает изменения, которые сказываются и на скорости ферментативных реакций и на обмене веществ в целом. Отмечают, например, что под влиянием присутствующего в питательной среде хлористого натрия при биосинтезе стрептомицина происходит изменение проницаемости клеточной мембраны; этим обеспечивается более легкий переход антибиотика из мицелия в культуральную жидкость. Металлы имеют большое значение в осуществлении ферментативных реакций. Некоторые металлы (цинк, железо, магний, марганец и др.) являются активаторами действия ферментов. У другой группы энзимов металлы входят в состав молекулы, такие энзимы называются металлоэнзимами. Механизм активирующего действия металлов на ферменты пока еще мало изучен.
Суммируя современные представления о механизмах участия катионов металлов в ферментативных реакциях, В. З. Горкин (1964) называет основные из них: а) металл является составной частью каталитически активного центра фермента, б) металл создает или стабилизирует определенную конформацию белковой молекулы, необходимую для обеспечения каталитического действия фермента, в) металл воздействует на субстрат, изменяя его электронную структуру таким образом, что он легче вступает в ферментативную реакцию, г) металл обеспечивает присоединение кофермента к апоферменту или активацию кофермента, д) металл выполняет функцию «мостика», связывающего фермент и субстрат при образовании из них промежуточного соединения, е) роль металла в ферментативной реакции обусловлена сочетанием тех или других перечисленных выше механизмов.
Один из изложенных тезисов о механизме участия металлов может быть проиллюстрирован на примере флавопротеинов. При действии фермента нитратредуктазы функции флавинаденин-динуклеотида и металла сопряжены между собой. В данной реакции молибден является переносчиком электрона в реакции восстановления нитрата.
Прочность соединения металла с ферментом обычно определяют путем диализа. Для установления наличия определенного металла в ферменте используют реакции, которые связывают металл и вызывают угнетение ферментативной активности. Если путем введения ингибитора в сферу ферментативной реакции удается подавить действие фермента, а затем введением определенного металла удается осуществить реактивацию, то этот факт может свидетельствовать об участии металла в данной ферментативной реакции.
Из металлов, которые входят в качестве ингредиентов в питательные среды, при производстве антибиотиков большой интерес представляет железо. Помимо того, что железо в виде солей, чаще всего сульфата, входит в состав многих сред, оно входит в состав стали, из которой изготовлены ферментеры. При ферментации в аппаратах, изготовленных из углеродистых сортов стали, обнаруживается до 20—40 мкг железа на миллилитр среды.
При биосинтезе стрептомицина железо неодинаково влияет на рост продуцента и образование антибиотика. Оптимальные и токсические концентрации железа различны для разных штаммов. Для одного из штаммов отмечаются, например, следующие закономерности: 0,03 мг% железа достаточно для оптимального роста; оптимум для биосинтеза антибиотика находится в пределах 0,1—0,2 мг%. При более высоких концентрациях железа рост и образование антибиотика значительно падают. При 5,0 мг% железа рост составляет около 75% от максимального, а образование стрептомицина — только 45% от максимума.
На синтез стрептомицина оказывает также влияние форма, в которой присутствует в среде железо. В частности, при образовании в среде геля железа (коллоидного железа) мицелий покрывается тонкой его пленкой, при этом дыхательный коэффициент понижается, рост культуры и биосинтез стрептомицина значительно угнетаются Угнетающее действие железа на биосинтез окситетрациклина связывают с присутствием в среде масел, используемых при пеногашении. При одинаковом количестве железа в питательной среде угнетение биосинтеза выражено более ярко там, где присутствует масло с большим йодным числом, т. е. с большим количеством ненасыщенных связей. Например, в присутствии подсолнечного, льняного и соевого масел, т. е. масел с большим йодным числом, угнетающее действие железа выражено особенно ярко. С другой стороны, присутствие железа практически не снижало образование окситетрациклина в присутствии веществ с низким йодным числом — пальмового масла или животного жира. Как полагают, подавляющее действие ненасыщенных масел в присутствии железа связано с образованием перекисей. Пока еще не ясно, действует ли перекись прямо или косвенно, путем образования перекиси водорода.
На образование пенициллина железо оказывает стимулирующее влияние в ограниченных пределах концентрации. После достижения некоторой величины дальнейшее повышение концентрации железа на биосинтезе пенициллина заметно не сказывается.
При проведении промышленных ферментаций важно иметь в виду, что с течением времени внутренняя поверхность ферментера покрывается защитной коллоидной пленкой, которая значительно препятствует коррозии и переходу железа в среду.
Помимо железа, большое значение для биосинтеза антибиотиков имеют цинк, медь, марганец, молибден, бор, калий, магний, кальций и др. Первые пять из названных элементов применяются в микроколичествах и часто наличие их в виде примесей с основными компонентами среды оказывается достаточным для нормального развития микроорганизмов.
Широко применяемый в промышленности кукурузный экстракт содержит, по данным эмиссионного спектрального анализа золы, следующие элементы: алюминий, мышьяк, бор, кальций, хром, кобальт, медь, железо, свинец, литий, магний, марганец, никель, фосфор, калий, кремний, серебро, олово, вольфрам, цинк. Одна из партий кукурузного экстракта имела следующее содержание некоторых элементов (в % на сухой вес):
Вода, на которой готовятся питательные среды, содержит многие минеральные вещества. При изучении двух питательных сред одного состава, используемых для биосинтеза стрептомицина, но приготовленных на дистиллированной и водопроводной воде, оказалось, что активность была выше на среде, приготовленной на водопроводной воде.
Какие-либо оптимальные концентрации минеральных компонентов, универсальные для всех сред и антибиотиков, не могут быть рекомендованы, так как эти величины будут эффективны только применительно к данным условиям опыта, к данному соотношению ингредиентов. Соотношение минеральных компонентов среды и их взаимное влияние приходится учитывать при составлении сред или подбирать эти соотношения опытным путем. Было, например, подобрано для одного из штаммов пеницилла, образующего пенициллин, следующее соотношение некоторых компонентов среды — КН2РO4: MgSO4 : NaNO3 = 0,475 : 0,05 : 0,475.
В средах может проявляться действие так называемого антагонизма ионов, когда один из катионов может снимать действие другого катиона. Может быть приведен пример, когда биосинтез пенициллина угнетается CuSO4 · 5Н2O. При дополнительном введении в среду Fe2(SO4)3 угнетающее действие иона меди снимается и активность культуральной жидкости оказывается равной контролю.
Аналогичный пример может быть приведен с угнетением активности маннозидострептомициназы Str. griseus. При введении в среду двухвалентного железа (около 50 мкг/мл) полностью подавляется проявление ферментативной активности. Однако одновременное внесение в среду двухвалентного кальция снимает ингибирующее действие железа. В случае, если двухвалентный никель угнетает образование маннозидострептомицина, то это действие может быть снято введением железа.
В некоторых случаях ионы металлов входят в состав молекулы биологически активных веществ. Например, кобальт входит в состав витамина B12. В этом случае обязательным является присутствие соли кобальта в качестве компонента среды.
Примером других веществ, содержащих в модекуле металл, могут быть сидеромицины и сидерамины, синтезируемые актиномицетами и грибами. К их же числу относятся антибиотики альбомицин и гризеин, в состав молекулы которых входит железо. Для биосинтеза этих антибиотиков необходимо наличие в среде солей железа.
Вследствие технических трудностей метаболизм минеральных соединений у микроорганизмов является одним из наименее изученных разделов обмена веществ.