Биохимические процессы образования белковых веществ в созревающем зерне пшеницы неоднократно служили предметом изучения. Еще в 1902 г. Недокучаев показал, что при созревании в зерне происходит постепенное накопление белкового азота за счет убыли небелковых азотистых соединений: аминокислот и амидов. Дальнейшие исследования, из числа которых упомянем работы Вудмена и Энгледоу (Woodman, Engledow, 1924), Тулайкова и Писаревского (1927), Кизеля, Агатова, Безингер и Каструбина (1936), Петрова (1938), Мак-Колла (McCalla, 1938), Княгиничева, Мутуль и Палиловой (1940), Коблета (Koblet, 1940), Проскурякова, Бундель и Бухариной (1941), Вакара (1949, 1950. 1952,1958), более подробно осветили ход и условия ферментативного синтеза белковых веществ из низкомолекулярных азотистых соединений, притекающих в зерно в период его налива из вегетативных частей растения.
Синтез белка идет наиболее интенсивно в начальный период созревания, достигая обычно максимума в конце молочной — начале восковой спелости зерна. В дальнейшем суточный прирост белкового азота снижается и в фазе восковой спелости накопление белка практически заканчивается. Соответственно этому наблюдается заметное снижение активности протеолитических ферментов по ходу созревания зерна от максимума в фазе молочной спелости (Проскуряков, Бундель и Бухарина, 1941). А. Кур санов и К. Брюшкова (1940) исследовали как гидролитическое, так и синтетическое действие протеаз при созревании пшеницы и отметили максимальную синтетическую направленность указанных ферментов в начале восковой спелости зерна.
Многие исследователи пытались проследить превращение отдельных групп белковых веществ при созревании пшеницы и с этой целью количественно определяли содержание альбуминов, глобулинов, глиадина и глютенина в зерне по ходу его налива.
Рассмотрим вкратце результаты этих работ в отношении спирто — и щелочнорастворимого белков, поскольку глиадин и глютенин входят в состав клейковины и наличие их в опре-деленные фазы созревания зерна представляет интерес для выяснения вопроса об условиях образования клейковины.
Обстоятельные данные о динамике глиадина и глютенина в созревающей пшенице были опубликованы еще в 1924 г. Вудменом и Энгледоу (Woodman, Engledow). В результате последовательного экстрагирования одной и той же навески свежего материала 1%-ным NaCl, 70%-ным спиртом и 0,2%-ным КОН, начиная с молочной спелости зерна и далее через каждые 3—5 дней до полного созревания, данные авторы показали, что составные части клейковины — глиадин и глютенин имеются в зерне уже на ранних стадиях его развития. Так, в фазе молочной спелости, когда сухой вес зерна составлял лишь 15% от его веса в зрелом состоянии, а влажность равнялась 72,5%, глиадин и глютенин уже могли быть обнаружены в количестве 0,15% азота от сухого веса зерна для каждого из упомянутых белков. В последующие дни содержание глиадина и глютенина быстро увеличивалось, причем для глиадина это увеличение шло до самого конца созревания, а для глютенина оно прекращалось несколько раньше. Зрелое зерно содержало 1,02% азота глиадина и 0,56% азота глютенина при общем содержании белкового азота, равном 2,58%.
В работах Шарпа и Эльмера (Sharp, Elmer, 1924), Шарпа (Sharp, 1926), Мэнгельса и Стоа (Mangels, Stoa, 1928) также имеются данные о наличии глиадина и глютенина в зерне пшеницы на ранних стадиях созревания.
А. Р. Кизель с соавторами (1936) сравнил аминокислотный состав глиадина, выделенного из зерна в фазе молочной, восковой и полной спелости. Зерно молочной спелости имело влажность 55,6%, а сухой вес его составлял лишь 18% по отношению к весу зрелого зерна. В то же время оно содержало 0,24% азота глиадина и 0,43% азота глютенина (на сухое вещество). Аминокислотный состав глиадина из зерна молочной, восковой и полной спелости оказался не вполне идентичным: заметные различия были найдены в содержании гистидина, триптофана и в меньшей степени аргинина. Таким образом, во время созревания зерна происходит не только накопление отдельных белковых веществ, но и внутренняя их перестройка.
М. И. Княгиничев, И. Ф. Мутуль и Ю. К. Палилова (1940) исследовали содержание глиадина и глютенина в зерне по ходу созревания трех видов пшеницы: Tr. vulgare, Tr. durum и Tr. monccoccum. Анализ свежего материала показал, что содержание азота глиадина увеличивалось от 0,24—0,32% в зерне молочной спелости до 0,85—1,36% в зерне полной спелости. Содержание глютенина в тех же образцах повышалось соответственно от 0,32—0,46% до 0,93—1,07%.
В более позднее время А. Б. Вакар (1949, 1950, 1952, 1958) подробно изучил динамику накопления глиадина и глютенина в созревающем зерне пшеницы в связи с вопросом образования в нем клейковины. Анализу подвергалось зерно с самого начала его формирования, когда оно еще не достигло даже так называемой «зеленой спелости» и имело размер около
—V2 нормального. Влажность его при этом превышала 70%, а количество сухого вещества составляло менее 5% от веса зрелого зерна. В последующие фазы созревания пшеницы, соответствующие зеленой, молочной, восковой и полной спелости, также отбирались пробы зерна. В некоторых опытах материал анализировался в свежем состоянии, а в других предварительно обезвоживался с помощью лиофилизации или быстрой сушкой в токе теплого воздуха (при 35—40°). В качестве примера приведем результаты одного из опытов.
Как видно из таблицы, небольшие количества глиадина и глютенина, наряду со значительным количеством глобулина, имеются в зерне уже на самых ранних этапах его формирования.
Находятся ли клейковинные белки — глиадин и глютенин — в эндосперме пшеницы в свободном состоянии или же с самого начала созревания зерна они связаны в комплекс, как в отмытой клейковине зрелого зерна?
Для решения этого вопроса автор (Вакар, 1949, 1952) применил методику фракционирования белковых веществ пшеницы по ходу ее созревания растворителями — 5%-ным K2SO4, 70%-ным этанолом, 0,1 п КОН и 12%-ным салицилатом натрия— в различной последовательности.
Специальными опытами на очищенных препаратах глиадина и глютенина, а затем непосредственно на муке, было предварительно установлено, что водный раствор салицилата натрия (12%) хорошо растворяет клейковину и глиадин, но почти не растворяет глютенин. Так, непосредственно из муки 12%-ный раствор салицилата натрия извлекает около 86% клейковины. Если же предварительно удалить из муки глиадин с помощью разбавленного спирта, то 80% оставшегося глютенина уже не извлекается раствором салицилата.
Следовательно, по величине растворимости глютенина в водном растворе салицилата натрия можно судить о том, находится ли глютенин в свободном состоянии или же он входит в состав клейковинного комплекса.
Отдельные навески свежего зерна в разные фазы созревания последовательно экстрагировались растворителями по двум вариантам следующей схемы.
Вариант 1 позволяет определить обычным путем содержание глиадина и глютенина в зерне. Результаты анализа по варианту 2 дают возможность судить о том, находятся ли упомянутые белки в свободном состоянии или они связаны в комплекс, подобный клейковине. В последнем случае сумма глиадина и глютенина, определяемая по данным варианта 1, должна совпадать с количеством белка, извлекаемого салидилатом (вариант 2), или быть близкой к нему, поскольку последний практически полностью растворяет клейковину. Если же белковые фракции находятся в свободном состоянии, то салициловый раствор сможет извлечь лишь глиадин, и количество азота в щелочных экстрактах обоих вариантов, должно быть приблизительно одинаковым.
Результаты этих опытов, показывают, что с самого раннего периода созревания зерна глиадин и глютенин не обнаруживаются в свободном состоянии, но образуют некоторый комплекс, подобный клейковине по своей растворимости в салицилате. Это следует из равенства суммы глиадин + глютенин и количества белка, извлекаемого раствором салицилата. Такая закономерность наблюдается в течение всего периода созревания до восковой спелости, когда анализ обнаруживает небольшие количества белковых фракций, не извлекаемых салицилатом. Это объясняется неполным растворением клейковины в растворе салицилата натрия, особенно ввиду больших трудностей хорошего измельчения свежего материала.
Возможно, что аминокислоты, по мере их поступления в созревающее зерно, синтезируются непосредственно в макро-молекулы клейковинного белка без промежуточного образования отдельных составных частей его — глиадина и глютенина.
Таким образом, хорошо установлено, что отдельные белковые вещества, входящие в состав клейковины, можно обнаружить в созревающем зерне на ранних фазах его развития. Во всех рассмотренных выше работах определяли глиадин и глютенин как наиболее изученные фракции клейковины, но совершенно ясно, что подобные результаты могли бы быть получены и по отношению к другим белковым фракциям клейковины. Примером этого может служить исследование Мак-Колла (McCalla, 1938), проследившего за динамикой белковых веществ, растворимых и не растворимых в нормальном водном растворе йодистого калия, по ходу созревания пшеницы. Тщательно измельченное свежее зерно обрабатывалось последовательно водой и нормальным раствором йодистого калия, а затем проводилось фракционирование центрифугатов с помощью трихлоруксусной кислоты, гидролиз белковых фракций и определение содержания в них амидного и аспарагинового азота. Оказалось, что абсолютное количество небелкового азота и воднорастворимого белка мало меняется по ходу созревания, тогда как содержание указанных азотистых соединений, выраженное в процентах от общего азота зерна, стремительно снижается. В то же время количество белка, растворимого и не растворимого в йодистом калии, быстро увеличивается как по абсолютной величине, так и в процентном выражении к общему азоту пшеницы. Содержание амидного азота в двух белковых фракциях — растворимой и не растворимой в йодистом калии, а также в небелковой фракции правильно возрастает по ходу созревания зерна, а содержание аргининового азота одновременно снижается. Исходя из того, что водорастворимый белок содержит значительно меньше амидного азота, чем другие фракции, и процент его незначительно изменяется при созревании, автор приходит к заключению, что главная часть водорастворимых белков является довольно стабильной и не участвует в образовании белков клейковины (KJ-растворимые и KJ-нерастворимые белки). Последние образуются непосредственно из небелковых соединений, минуя стадию водорастворимого белка.
В предыдущих работах того же автора (McCalla, Rose, 1935) было показано, что если дисперсию сырой клейковины в растворе салицилата натрия осаждать постепенно возрастающими количествами MgSO4, то можно получить ряд последовательных фракций клейковинного белка, растворимость которых полностью коррелирует с содержанием в них амидного азота. С другой стороны, при созревании зерна фракция небелкового азота содержит тем больше амидов, чем позднее взята проба, т. е. чем более зрелым является зерно. Кривые распределения амидного азота по фракциям клейковины и по фракциям небелкового азота при созревании зерна почти полностью совпадают. Автор предполагает, что содержание амидного азота наименее растворимой фракции клейковины относительно невелико, потому что эта фракция происходит из небелковых соединений, находившихся в зерне в начале его созревания.
С другой стороны, наиболее растворимые фракции клейковины содержат много амидного азота, так как они происходят из небелковых веществ, находившихся в зерне в конце созревания. Химическая природа промежуточных фракций клейковины определяется составом небелковых соединений на промежуточных стадиях созревания зерна.
Исходя из этих данных, Мак-Колла развивает следующую картину образования белков эндосперма. Когда начинается наполнение зерна, небелковые азотистые вещества перемещаются из вегетативных частей растения в зерно и здесь конденсируются в белки клейковины. Образующиеся белки постепенно снижают свою растворимость. Таким образом, фракции клейковины, образовавшиеся в самом начале созревания, являются наименее растворимыми к концу созревания и, кроме того, они характеризуются наименьшим содержанием амидного азота. Противоположными свойствами должны обладать белки клейковины, образовавшиеся в конце созревания: они наиболее растворимы и содержат больше амидного азота. Небелковые азотистые соединения по всему ходу созревания являются предшественниками соответствующих фракций клейковины.