При эмбриологическом исследовании злаков обычно используют ту же методику, что и при изучении большинства других растений. Вместе с тем злаки имеют ряд специфических особенностей. В связи с этим была усовершенствована техника эмбриологического исследования и использованы некоторые новые способы подготовки материала.
Ниже описаны использованные нами наиболее рациональные приемы подготовки и наиболее эффективные методы фиксации и окраски материала. Изучение можно проводить как на постоянных препаратах, так и на временных. В некоторых случаях отдельные процессы быстрее и удобнее изучать на живом материале.
Для исследования самых ранних стадий развития цветка и его элементов производят фиксацию всего колоса. После образования члеников колоса фиксируют отдельные колоски. На более позднем этапе развития колоса (перед колошением и в процессе колошения), когда колосковые и цветковые чешуи легко снимаются, удаляют их пинцетом. Чешуи снимают очень осторожно, так как легкое надавливание на завязь или пыльник ведет к повреждению и получению искаженных структур.
Для одной фиксации берут цветки с нескольких одинаково развитых колосьев, тычинки и завязи — из 2—3 цветков средней части колоса. В верхних и нижних колосках, а также в верхних цветках колоска завязи и пыльники отстают по развитию, нередко остаются недоразвитыми, и в них наблюдается много различных аномалий.
Иногда довольно трудно точно определить и найти нужную стадию изучаемого процесса. В этих случаях применялся метод темпоральных фиксаций, предложенный М. С. Навашиным (1934). Промежутки между последующими фиксациями устанавливают в зависимости от продолжительности каждого процесса. В некоторых случаях для установления необходимого момента фиксации цветка какой-либо конкретной стадии предварительно делают серию временных ацетокарминовых препаратов. В качестве фиксирующей жидкости можно использовать различные фиксаторы. Наиболее простые в обращении — фиксаторы Карнуа и ФАА. Хорошие результаты дает фиксатор Карнуа (6:3: 1) и его модификация (3 : 1), обладающие способностью быстро проникать в объекты с опушением и восковым налетом, характерными для злаков, и потому они часто используются при изучении почти всех эмбриологических процессов в злаках. Для исследования отдельных этапов, например процесса оплодотворения, лучше использовать смесь Навашина (10 : 4 : 1), а для изучения отдельных эмбриональных структур — и другие фиксирующие жидкости. Об этом будет рассказано ниже. Учитывая, что фиксация является весьма ответственным моментом, независимо от метода следует соблюдать следующие условия.
1. Перед фиксацией материал (в силу наличия опушения и воскового налета на завязи) предварительно помещают на 1—2 мин в раствор мочевины — 0.5 г/100 см3, или сахарозы— 1.0 г/10 см3, или в смесь 96%-ного спирта с уксусной кислотой (3: 1), или же в 70%-ный спирт.
2. Лучшие результаты дает холодный фиксатор, поэтому в жаркую погоду пробирки прикапывают между делянками (если фиксация проводится в поле).
3. Заменяют фиксатор свежей порцией через 20—30 мин.
4. В фиксаторе Карнуа материал держат не более 2—3 ч, после чего промывают в 100 %-ном спирте до исчезновения запаха уксусной кислоты (1.5—2 ч при 3—4-кратной смене спирта). Если обстоятельства не позволяют, можно оставить на 1—2 сут.
5. В фиксаторе Навашина материал держат от 4 до 24 ч.
6. Строго выдерживают соотношение объемов материала и фиксатора, которое должно быть не менее чем 1 : 10.
7. Нужно следить, чтобы материал не плавал на поверхности и был полностью погружен в фиксирующую жидкость.
В случае применения смеси Карнуа материал промывают в 100 %-ном спирте и подвергают следующей проводке: через 100 %-ный (I) спирт — 60 мин, через 100 %-ный (II) спирт — 60 мин, через смесь I (спирт 75 %, хлороформ 25 %) — 2 ч, через смесь II — 2 ч, через хлороформ — 1—2 ч, через хлороформ III — 1 ч. Далее переносят в чистый хлороформ и заливают парафином.
Из рекомендаций различных авторов мы предпочитаем следующую методику обезвоживания и проводку через смеси (при фиксации смесью Навашина): промывка в воде в течение 1.5—2 ч, проводка через 10 %-ный спирт — 10 мин, 20 % — 20 мин, 30 % — 30 мин, 40 % — 40 мин, 50 % — 50 мин, 60 % — 60 мин, 70 % — оставлять на ночь, 80 % — 60 мин, 90 % — 60 мин, 96 % — 60 мин, 100 %-ный (I, И) —60 мин, проводка через смесь I (спирт 75%, хлороформ 25 %) — 2 ч, через смесь II (50 и 50 %) — оставлять на ночь, через смесь III (25 и 75 %) — 2 ч, проводка через хлороформ (I, II) — 1—2 ч и заливка парафином. Парафин лучше брать с точкой плавления 54—56 °С, а для тонких срезов — 60—62 °С.
Для цитохимических реакций можно использовать смесь Карнуа и некоторые другие.
Отдельные этапы развития пыльцы можно изучать при помощи ацетокарминового метода. Более подробно эта методика будет описана ниже. Для окраски препаратов используют следующие красители: генцианвиолет по Ньютону, танин—хлорное железо—сафранин по Иогансену, гематоксилин по Гейденгайну, Эрлиху и Делафильду, основной фуксин по Модилевскому. Эти красители, кроме того, лучше всего использовать с различными подкрасками — эозином, оранжем Ж, конгокоринтом. Для выявления ДНК и РНК препараты окрашивают реактивом Шиффа и по Унна.
Говоря о фиксации и окраске, нельзя не отметить те особенности методики, которые способствуют более правильному пониманию отдельных эмбриональных структур злаков.
Ряд исследуемых структур (завязь, семяпочка, зародышевый мешок, зародыш) имеет дорсовентральное строение. Поэтому такие структуры следует изучать в дорсовентральной, билатеральном и трансверсальном сечениях. Без сопоставления срезов, сделанных в разных сечениях, правильно понять развитие некоторых структур сложно. Кроме того, отдельные моменты развития лучше выявить на поперечных срезах, чем на продольных (например, расположение пыльцы в гнезде пыльника и образование каллозы).
Многие структуры (яйцевой аппарат, полярные ядра, антиподы и др.) располагаются хотя и на одной продольной оси, но на разных уровнях, поэтому их надо изучать на серии срезов и в разных плоскостях. В связи с этим на рисунках лучше давать «совмещенный» срез, на котором изображаются все структуры, хотя они и лежат на разных уровнях. Один медианный срез через завязь, сделанный в билатеральном, дорсовентральной или трансверсальном сечениях, не отражает положение и строение всех ее структур. Это касается и изучения материала под электронным микроскопом; при этом желательно давать сделанные при малом увеличении схему или фотографию для ориентировки в представленных микрофотографиях.
К сожалению, большая часть исследователей не обращает должного внимания на то, в каком сечении они изучают те или иные структуры, а это приводит к разной трактовке наблюдаемых явлений, к противоречивым выводам и затрудняет анализ существующих данных.